研究甘蓝育种的意义与价值论文

（一）结球甘蓝细胞形态学研究

到目前为止，在对结球甘蓝抗逆、抗病、雄性不育与自交不亲和材料及创新种质资源的细胞形态学方面，国内外都做了一些研究，取得了长足的进展，对于种质资源的利用和创新具有重要的意义。

王丽娟、秦智伟（1995）对甘蓝裂球性的解剖学进行了研究，找出甘蓝易裂球品种和抗裂球品种在叶片结构上的差异。认为抗裂球品种的叶表皮细胞壁比易裂球品种的叶表皮细胞壁厚，因而机械强度大，细胞壁机械强度大可能是抗裂球品种不裂的原因之一。易裂品种球叶的叶肉细胞间隙大，因而吸水力强，使其韧性大大降低，可能是易裂品种叶球易裂的原因之一。此项研究对于探讨甘蓝裂球机理提供了初步的理论依据。

在甘蓝的抗逆性研究中，向珣等（2001）研究了热胁迫下，不同抗热性甘蓝叶片细胞的细胞膜、叶绿体及线粒体结构。结果表明，抗热材料在细胞膜及叶绿体结构上较热敏材料更完整，可作为抗热性鉴定标准之一，材料间在线粒体结构上则未发现有明显差异。Ristic等（1992）也研究认为，热胁迫下，叶绿体结构在材料间出现明显差异，而线粒体结构变化在材料间相似。同时，针对热敏材料本身，线粒体较叶绿体结构更为稳定。

在创新种质资源的细胞学研究中，满红、张成合等（2005）在进行结球甘蓝4x×2x和2x×4x的授粉受精及胚胎发育观察基础上，结合幼胚离体培养技术，成功地获得了结球甘蓝三倍体材料，并对其减数分裂行为、染色体在后期Ⅰ的分离及雌雄配子的传递率进行了观察研究，这为创建结球甘蓝“初级三体系”等珍贵材料及其遗传研究奠定了基础。葛亚明、陈利萍（2006）以榨菜（茎瘤芥）和甘蓝为材料，通过离体靠接法人工合成了两者的种间嵌合体，并分析了其细胞学特性，结果表明：不同类型嵌合体的叶片组织解剖结构不同。该研究为利用该嵌合体进行细胞互作、器官形态发生等基础理论研究提供了良好的试验体系，同时也为榨菜和甘蓝种质资源创新提供了一条新途径。

在甘蓝雄性不育材料的细胞学研究中取得了一些重要进展。刘玉梅（2003）以甘蓝显性雄性不育材料DGMS79-399-3为材料，从细胞形态、亚细胞水平对甘蓝显性细胞核雄性不育机理进行了研究，明确了该不育材料花药败育的时期和主要特征，探明了甘蓝显性细胞核雄性不育在细胞学方面的败育机理，为该不育材料在甘蓝类及其他十字花科作物中更有效、更合理的利用提供了理论基础。首次系统观察比较了甘蓝显性细胞核雄性不育材料中不育株、微量花粉株与可育株花药发育过程中细胞超微结构的变化（图10-17至图10-24）。发现甘蓝显性细胞核雄性不育株花药败育时期最早发生在花粉母细胞早期，败育高峰期在花粉母细胞至小孢子单核期，微量花粉株花药败育时期最早发生在花粉母细胞减数分裂前期，败育高峰在花粉母细胞减数分裂后期至小孢子单核期。从亚细胞水平上明确了甘蓝显性细胞核雄性不育基因表达的特征。与正常可育株相比，甘蓝显性细胞核雄性不育花药发育过程中的败育特征主要是：线粒体、内质网、细胞核、质体、液泡等细胞器结构破坏直至解体；花粉母细胞从发育早期至减数分裂后期，细胞形态和超微结构均出现异常现象，在花粉母细胞发育早期表现细胞壁特厚，细胞核、核仁较小，细胞间胼胝质厚（图10-17、图10-18），不育花药花粉母细胞减数分裂前超微结构细胞核出现异常现象，线粒体等细胞结构开始破坏（图10-19、图10-20）；部分花粉母细胞不能进行正常减数分裂或停止生长发育；绒毡层发育异常，提前解体；四分小孢子外被一层很厚的膜状物包被，四分小孢子不能正常生长发育，四分孢子间胼胝体不能正常分解，四分体不分开（图10-21、图10-22）；成熟不育花粉粒内部线粒体等细胞器及内含物全部降解（图10-23、图10-24），花粉粒成空壳状，花粉壁发育不全，扭曲变形；药壁细胞生长缓慢，其体积大小约为可育药壁的1/2。

图10-17 可育花药花粉母细胞发育早期超微结构

（细胞核大、居中，核仁大）（×3 500）

图10-18 不育花药花粉母细胞发育早期超微结构

（细胞核、核仁较小，细胞间胼胝质厚）（×3 500）

图10-19 可育花药花粉母细胞减数分裂前超微结构

（花粉母细胞内细胞器十分丰富）（×12 000）

图10-20 不育花药花粉母细胞减数分裂前超微结构

（细胞核出现异常现象，线粒体等细胞结构开始破坏）（×12000）

图10-21 可育株四分孢子形态超微结构

四分孢子间有许多胞间连丝，四分孢子间胼胝质基本溶解（×3000）

图10-22 不育株四分孢子形态超微结构

形态异常的四分孢子不分开，四分孢子间及孢子外包被厚厚的胼胝质（×3000）

图10-23 成熟可育花粉粒内部超微结构

线粒体等细胞器丰富（×20000）

图10-24 成熟不育花粉粒内部超微结构

线粒体等细胞器及内含物全部降解（×20000）

刘玉梅（2003）研究并明确了不同育性甘蓝DGMS材料花粉细胞学形态特征。甘蓝显性细胞核雄性不育的花粉经醋酸洋红染色，在光学显微镜下观察，花粉外形为多种不规则形状，花粉染色浅或不被染色，花粉内含物和外壁完全破坏。扫描电镜下，败育花粉形态异常，花粉外壁凹陷、皱缩成毡帽状，多个花粉粘连成莲座状，花粉外壁纹饰不明显或不能形成纹饰，部分畸形花粉的外壁表面为锯齿状或瘤状突起，未发育好的早期花粉成棉花状和花椰菜状细胞团（图10-25）。

图10-25 甘蓝DGMS79-399-3可育与不育花粉形态扫描电镜图

卞春松（1994）研究表明，Ogura甘蓝异源胞质不育系败育在幼嫩小孢子期，黑芥不育异源胞质败育在造孢细胞时期，甘蓝显性核不育材料79-399-3败育主要在四分体期，甘蓝隐性核不育97A败育发生在减数分裂前期。漆红艳等（2006）对500个自交不亲和性甘蓝纯合二倍体花粉母细胞减数分裂各时期染色体行为进行了观察。朱金鑫等（2004）对结球甘蓝花序发育过程中顶端结构的解剖学变化也进行了研究，结果表明，甘蓝顶端亚外套两侧细胞分裂分化形成顶生叶原基，在顶生叶原基内侧的细胞将进行分裂产生花序侧枝原基，进而形成侧生花序枝。

（二）原生质体培养与融合研究

远缘种属之间由于遗传或生理障碍的存在，很难杂交成功，但通过原生质体培养和体细胞融合技术，可克服生殖障碍，实现遗传物质之间的交流。

结球甘蓝原生质体培养自20世纪80年代初期由Lu等（1982）以基因型Greyhound的子叶为材料对游离原生质体进行培养首次获得成功以来，至今已取得了较大的进展。已相继从Market Prize和报春的真叶（Bindney et al.，1983；傅幼英等，1985），Ladi、Ladi×Golden和N101的根（Lillo et al.，1986），秦菜3号的子叶（孙振久，1993），N101和小鸡心的下胚轴（Lillo et al.，1986；钟仲贤等，1994）等外植体为材料的游离原生质体培养中获得了再生植株，为甘蓝在原生质体水平上的遗传转化及种质资源创新打下了基础。

随着甘蓝原生质体培养及植株再生技术的突破，原生质体融合也取得了很大进展。自从Schenck等（1982）首次利用原生质体融合获得Early Spring、Savoy King、Stone Head等结球甘蓝与Tendergreen等白菜体细胞杂种后，各国有关学者对这一技术进行了深入的研究。日本学者Taguchi等（1986）获得了结球甘蓝与白菜叶肉原生质体融合的再生植株。雷开荣等（1999）通过结球甘蓝Toskama与萝卜NeoroRA12984原生质体融合获得了再生植株。

（三）远缘杂交与胚培养研究

通过远缘杂交结合幼胚培养，已获得了白菜与甘蓝、萝卜与甘蓝、甘蓝型油菜与甘蓝的远缘杂种植株。满红、张成合等（2005）在对结球甘蓝4x×2x和2x×4x的授粉受精及胚胎发育观察的基础上，结合幼胚离体培养技术，成功地获得了结球甘蓝三倍体材料。

程雨贵等（2006）用基因组原位杂交方法（Genomicinsituhybridization，GISH）研究了萝卜（Raphanus sativus，2n=18，RR）和甘蓝（Brassica oleracea，2n=18，CC）属间杂种F1减数分裂过程，结果表明杂种体细胞染色体组成为RC，2n=18，但花粉母细胞有3种类型：第一种类型为RC，2n=18，终变期染色体平均配对构型为14.87+1.20+0.04+0.06，染色体配对主要发生在萝卜和甘蓝染色体之间；后期9条萝卜染色体主要以4/5和3/6的分离比移向两极，所形成配子的染色体数目和组成均不平衡，配子败育。第二种类型是RRCC，2n=36，终变期染色体形成18个二价体；后期染色体均衡分离，

形成RC不减数配子。第三种类型是RRCC亚倍体，2n=30～34，少数萝卜染色体丢失，形成的配子具有全套的甘蓝染色体和部分萝卜染色体。

（四）花药、花粉（游离小孢子）培养研究

花粉母细胞经减数分裂之后形成的小孢子，在正常条件下发育成成熟的花粉粒，即配子体发育途径，若在外界胁迫的条件下，就会转向孢子体发育途径，形成小孢子胚，进而发育成单倍体植株（Nitsch and Norreel 1973；Touraev et al.，1997）。这种通过雄核发育诱导单倍体的方法有2种，花药培养和游离小孢子培养。游离小孢子培养的技术是在花药培养技术的基础上发展而来的，但它比花药培养产生的单倍体频率高，而且不受花药壁、花药隔等母体组织的影响，因此，游离小孢子培养有着花药培养不可代替的优点。获得的单倍体植株经过自发或诱发的染色体加倍，成为正常可育纯合二倍体植株。

Keller ＆ Armstrong（1981）首次报道了甘蓝花药培养的成功。但这一技术在实际应用中存在两大问题：一是产生植株的倍性具有不可预测性，二是很多基因型产胚率极低（Lelu and Bollon，1986）。1982年Lichter等成功诱导出甘蓝型油菜游离小孢子胚及再生植株，为甘蓝游离小孢子培养奠定了坚实的基础。自Lichter（1989）和Takahata（1990）最早在结球甘蓝上成功得到了游离小孢子再生植株以来，各国学者对甘蓝游离小孢子培养技术进行了较深入的研究，并已在结球甘蓝上取得了一些进展。对结球甘蓝小孢子培养的研究主要集中在小孢子胚胎发生的影响因素、植株再生及染色体加倍方面。

1.小孢子胚胎发生的影响因素

（1）供体植株的基因型 通过对不同基因型的甘蓝游离小孢子培养的研究表明，供体植株的基因型对小孢子胚胎发生的影响极为重要，它不仅影响产胚率，而且也影响胚的质量（Chuong et al.，1988）。Duijs等（1992）对Bindsachsener-CPRO bra88045和Jersey Queen等15份结球甘蓝品种进行了游离小孢子培养，在其中14份材料中获得了胚，其胚胎产生的频率为0.1%～7.4%。张风兰等（1994）对爱知大晚生、野崎早生等8个结球甘蓝品种进行了游离小孢子培养，结果只有其中4个品种产生了小孢子胚，且胚胎发生的频率均较低，研究表明胚胎发生能力主要受核基因控制，呈部分显性遗传。Kudolf等（1999）通过用出胚率高的基因型（Hawke、R1、R2）与难出胚的基因型（V? dinsko）进行杂交，在其后代获得了较高的出胚率，认为控制胚胎发生的基因存在于高出胚基因型中，并呈现出高度的遗传力。中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝组袁素霞等2005年春对5份结球甘蓝材料进行了游离小孢子培养，在每份材料中均获得小孢子胚。其中中甘11的出胚率最高，每个蕾达18.07，中甘8号最低，每个蕾为0.03个。

（2）小孢子培育取样时期 小孢子发育时期一般分为单核期、双核期和三核期，并非任何时期的小孢子都适于培养。小孢子发育时期、花蕾大小、取样位置和取样时期都会影响到小孢子培养效果。一般认为，在单核靠边期为取样适宜时期。但不同基因型有一定的差异。方淑桂等（2005，2006）认为强夏甘蓝在盛花期取材最为适宜，而且只有单核晚期至双核早期的小孢子才能发育成胚状体。汤青林等（2000）认为甘蓝游离小孢子培养取主花序上的花蕾效果较好。Takahata等（1991）曾报道，只要所选取的小孢子的发育时期合适，花序和植株年龄对胚胎发生都没有影响。

（3）预处理 对小孢子进行预处理是利用一种逆境（环境胁迫）来诱导胚胎的形成（Lichter，1982；Touraev et al.，1997）。预处理包括离心、低温、高温、射线、秋水仙素、饥饿等处理。目前在甘蓝上广泛应用的预处理为高温预处理。甘蓝小孢子培养一般在30～35℃下预处理24～48h可明显提高胚状体诱导率。中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝组袁素霞等研究表明，32.5℃高温预处理1～2d有利于胚胎的发生，但大多基因型以32.5℃处理1d的效果较好。

（4）培养基及其成分 目前在甘蓝游离小孢子培养中，广泛采用的冲洗基本培养基为B5培养基（Gamborg et al.，1968），最后用来游离小孢子培养的培养基为NLN培养基（Lichter，1982）。培养基的pH值也是诱导小孢子胚胎发生的一个关键因素（Ballie et al.，1992），pH可能充当着一个调节物，它调节小孢子与培养基之间的物质交换（Gland et al.，1988），在甘蓝游离小孢子培养中pH值通常调至5.8。培养基中加蔗糖不仅为小孢子培养提供碳源，而且还调节培养基的渗透压，在甘蓝游离小孢子培养中多采用13%蔗糖的培养基。方淑桂等（2005，2006）先用17%蔗糖浓度的培养液培养强夏的游离小孢子，4d后再添加8%蔗糖浓度的培养液可显著提高其胚产量。在甘蓝游离小孢子的培养过程中加入适量的活性炭（AC）可以加快离体培养进程，提高产胚率，一般认为，甘蓝类小孢子培养宜用0.5～1g/L的活性炭。朱至清等（1978）认为外源激素对花粉细胞去分化启动不是必需的，但它能防止多细胞花粉的败育，使较多细胞形成愈伤组织。田笑明等（1987）认为，初始培养液中加低浓度的激素有利于花粉小孢子启动，而到小孢子第二次有丝分裂间需要提高激素水平，所以小孢子早期分裂时不需要高激素水平，但不加是不利的，因为到了花粉小孢子第二次有丝分裂期间需要提高激素的水平，从而进一步说明在培养早期适时调整激素成分是必要的，可以明显促成多细胞花粉的形成。刘艳玲等（2006）通过对20个基因型的结球甘蓝材料（由北京市农林科学院蔬菜研究中心甘蓝课题组提供，G1-G20）进行游离小孢子培养，结果表明基因型、蔗糖浓度对胚发生能力影响最大，除个别基因型对蔗糖浓度有较高的要求外，蔗糖浓度在13%、激素组合NAA（0.05mg/mL）+BA（0.1mg/mL）的培养基适合较多基因型的小孢子胚发生，在培养基中添加适量活性炭能明显地提高出胚率。袁素霞等研究结果表明，加入6-BA并不是对所有基因型都有促进作用，如，0.05mg/L 6-BA对8398有时起促进作用，而0～0.2mg/L 6-BA对中甘11具有抑制作用。培养温度和光照对甘蓝小孢子胚发生影响很大，甘蓝以32.5℃暗培养1～2d，然后再转入25℃条件下继续暗培养2～3周直至形成子叶形胚为宜。

2.小孢子植株再生和染色体加倍

胚的直接成苗率与培养基、胚的质量以及供体植株的基因型都有关。在甘蓝上最常用的方法是，把胚直接接在不含任何激素的B5固体培养基（2%的蔗糖）或MS培养基上，25℃、16h的光照条件下培养3～4周即可发育成小植株。Hansen等（2000）曾报道，先用5mg/L ABA处理胚1h，然后再干燥处理12～90d，可使胚的萌发率达到100%，这一方法已经在甘蓝上得以应用。

小孢子培养得到的单倍体植株，通常表现为高度不育，为了能使之正常结籽，与育种实践相结合，必须诱导染色体加倍。染色体加倍的方式有两种，一是发生在游离小孢子培养时期，二是对成苗的小孢子后代植株进行人工加倍。Kasha（2005）报道，自然加倍与预处理有关，预处理可能会造成均等分裂后细胞壁形成的失败，从而导致核的融合。此外，还与预处理时的小孢子发育时期有关，单核期的小孢子可能产生较高频率的双单倍体，双核早期的小孢子可能会导致产生更多的三倍体或其他水平的多倍体。Rudolf等（1999）报道，在小孢子培养中加入反细胞分裂剂，可提高自然加倍率。Kudolf等（1999）还对小孢子植株再生及再生群体的染色体加倍进行了研究，结果表明，通过ABA干燥处理小孢子胚可以提高胚再生植株的频率，利用抗微管形成的化学物质对游离小孢子处理可以提高再生群体的自然加倍率。杨丽梅等（2003）研究表明，通过小孢子培养获得的组培苗大部分在培养过程中可自然加倍成双单倍体植株，她们从8398中获得的5个胚的组培苗，其中有4个胚（胚1、2、4、5）的组培苗全部自然加倍，而来源于第3个胚的9株组培苗中，有2株未加倍，总自然加倍率达84.6%。袁素霞等（2007）研究结果显示，小孢子后代群体的加倍率因基因型而异，如中甘11在获得的245个胚再生植株中，有176个发生了自然加倍，加倍率为71.84%；而8398在获得的393个胚中，只有188个发生了自然加倍，加倍率为47.84%。