糖化酶的研究进展论文

如今还健在的微生物界牛人 1.田波，男，1931年12月25日生于山东桓台县，中国科学院微生物研究所分子病毒学与生物工程研究室主任，研究员、院士、博士生导师，著名病毒学与生物工程专家 1954年8月 北京农业大学植保系毕业 1954年8月至1962年6月 中国科学院微生物所研究实习员, 1958年后任课题组长 1962年7月至1978年12月 中国科学院微生物所, 助研, 课题组长, 1977年后任研究室副主任 1979年1月至1986年4月 中国科学院微生物所, 副研, 研究室副主任, 1983年后任主任 1986年5月至1991年12月 中国科学院微生物所, 研究员, 博士生导师, 研究室主任 1991年12月至今 中国科学院院士, 研究员, 博士生导师, 研究室主任 对中国的植物病毒、类病毒和生物工程有系统的研究, 1983年首次报导了应用卫星RNA防治黄瓜花叶病毒获得成功。通过卫星RNA生防制剂和包括卫星 RNA 在内的多基因抗病遗传工程品种, 在田间大面积应用中获得良好的防病增产效果, 并提出了卫星RNA除抑制病毒复制之外的一种新的抗花叶病机理。他所领导的实验室在生物工程方面开展了核酶工程、随机序列多肽库、抗体基因工程、基因工程医药和植物基因工程等研究, 获得在体内高度抗病毒和类病毒的转基因作物; 构建了胞内和表位多肽库并筛选到用于亲合层析和抗病毒的一些多肽; 构建和表达了几种抗肿瘤的抗体基因; 研制成功数种基因工程药物; 在几种作物上用基因工程方法获得了雄性不育系和恢复系, 为杂种优势利用奠定了基础。 在国内外重要学术刊物上发表论文150多篇, 专著五种。 2.张树政，女，1922年10月22日生于河北束鹿县。现任中国科学院院士、微生物所研究员、博士生导师。 1942－1945 北京大学理学院化学系毕业，理学士； 1945－1946 北京大学理学院化学系助教； 1946－1948 北京大学医学院生化科助教； 1948－1949 北京大学理学院化学系助教； 1950－1954 重工业部综合工业试验所技师； 1954－1957 中国科学院菌种保藏委员会助理研究员； 1958－现在 历任中科院微生物所副研究员、研究员、博士生导师、酶学研究室副主任等职。 1991－现在 中国科学院院士 1992－现在 中国科学院生物学部常委 60年代初，在国内首先用纸电泳、酶谱和生长谱法分析比较了当时在酒精工业界有争议的不同种曲霉淀粉酶系的组成，确定了黑曲霉的优越性。60年代阐明了白地霉的戊糖代谢途径，发现白地霉中有甘露醇，查明了其合成途径。发现并纯化了NAP－甘露醇脱氢酶。70年代在国内首先建立了等电聚焦和聚丙烯酰胺凝胶电泳等新技术。在红曲霉糖化酶的研究中，首次得到该酶的结晶，并发现该酶的不同分子型存在构象差异，证明是糖基化程度不同引起的（现称为糖型）。80年代从事多种糖苷酶的应用和基础研究。如细菌(－淀粉酶高产菌株活力在国际上当时领先，果胶酶的应用，右旋糖酐酶已证明有防龋效果，产麦芽四糖的淀粉酶有工业化前景。首次发现了有严格底物专一性的(－D－岩藻糖苷酶，由嗜热菌纯化了5种酶。90年代在国内大力倡导糖生物学和糖工程前沿计划，并建立了糖工程实验室 。 3.魏江春男，1931年11月11日生。研究员、博士生导师、中国科学院院士 自1963年以来一直从事中国地衣区系与分类研究，同时对世界范围石耳科 (Umbilicariaceae)地衣进行了比较系统的研究。先后组织并参加了国家基金委、国家科委和中科院联合资助的重大项目中的三级课题《中国地衣志－石蕊科》，基金委资助的《用地衣进行北京地区大气质量评定的研究》及《世界范围石耳科地衣的综合研究》，中科院重大项目中的三级课题《西藏地衣研究》以及国家85攻关《南极菲尔德斯半岛生态系统的研究》中的《陆地生态系统的研究》。此外，还对中国地衣文献资料进行了整理与分析，对一些地衣类群，如袋衣科，肺衣科，地卷科，茶渍科等进行了初步研究。当前正在主持并参加由基金委、中科院和真菌地衣系统学开放实验室资助的中美合作项目《东亚－北美地衣型与非地衣型真菌的间断分布及其遗传趋异性研究》。自1990年以来，将注意力逐渐集中于地衣表型与基因型相结合的综合研究方面。在石耳科研究中通过PCR技术对地衣型真菌的核rDNA特定片断进行RFLP分析以及对某些疑难种的核rDNA特定片断进行序列测定，并结合形态学，解剖学，化学与地理学等多性状的综合比较进一步阐述了石耳科地衣的科、属、种级的分类学综合概念。 4.郑儒永女，1931年 1月10日生。 研究员、中国科学院院士、博士生导师，系统真菌学专业 一贯致力于真菌分类系统的合理化与完善, 研究小煤炱、白粉菌和毛霉等类 真菌多年。对我国白粉菌目的有关属种以及全世界范围内白粉菌目的所有属的全 型进行了详尽的研究, 澄清和订正了许多国际上有争议的问题, 发表了一个较为 合理和接近自然的白粉菌科属级分类系统, 受到国际公认。1987年与其他人合作 并主写了我国的第一本真菌志《中国白粉菌志》。在分类难度很大的毛霉目研究 中, 注意将形态特征结合生理生化及分子生物学特性和将无性型特征结合有性型 特征并取得了一些有意义的突破。在医学毛霉和内生毛霉方面亦注意开展研究。 共著书10本(主作2本), 发表在国内外学术刊物上和全国会议及国际会议论文62 篇(主作48篇)。 5.方荣祥 院士 男，汉族 1946年1月19日出生于上海，籍贯 安徽省绩溪县 工作单位及地址 中国科学院微生物研究所 北京中关村 100080研究员、博士生导师 电话及传真 62548243 电子邮件 6.我们学校的院士 李季伦（），男，河北乐亭人，教授，1995年当选为中国科学院院士。 1948年毕业于南京中央大学理学院生物系，留校任教。1950年至今，历任中国农业大学助教、讲师、副教授、教授。1980-1982年在美国Wisconsin大学生化系进修。1989年至今任中国农业大学“农业生物技术国家重点实验室”学术委员会主任；1992年至今任中国科学院微生物研究所“微生物资源前期开发国家重点实验室”学术委员会主任。曾兼任国务院学位委员会学科评议组成员（1985-1991年）、农业部科学技术委员会委员（1983-1995年）、清华大学兼职教授（1994-1996年）、中国微生物学会理事长（1991-1995年）和名誉理事（1995年至今）、《微生物学报》主编（1991年至今） 、《农业生物技术学报》主编（中、英文版，2002年 至今）。 长期从事农业微生物的教学和研究，培养了大量专业人才，其中包括60多名研究生。出版译著8册，发表文章 一百二十余篇。与俞大绂教授合编的《微生物学》在我国微生物界有较大影响，获国家新闻出版署优秀科技图书一等奖（1998年）。 在基础科学研究方面：系统地研究了生物固氮的问题，取得以下成就：（1）在固氮酶催化机制的研究中，证明了固氮酶催化HD形成是固氮酶的普遍特性，而且是绝对依赖N2的；并提出了固氮酶的双位点放H2模式；（2）在固氮螺菌分子遗传学研究中，建立了我国巴西固氮螺菌Yu62菌株的基因文库，克隆和测序了该菌的ntrBC、draTG、nifA、glnB、glnZ和flbD等基因，并分析了它们的功能；构建了能节约玉米氮肥20%的耐铵固氮基因工程菌株；（3）启动了我国豆科植物根瘤菌资源调查和分类的研究，建立了我国根瘤菌资源数据库，为以后的研究奠定基础。 在应用研究方面：先后研制和开发了赤霉素GA3和GA4+7(可用于促进植物生长)、玉米赤霉烯酮和玉米赤霉醇（可用于促进牛、羊增重，并首先发现它们也是高等植物的一类天然激素）、莫能菌素和马杜霉素（可用于预防鸡球虫危害）、以及阿维菌素和伊维菌素（可用于防治动植物的寄生虫）等农牧用微生物制剂，取得了重大经济效益和社会效益。 曾获北京市优秀教育工作者（1986年）、五一劳动奖章（1986年）、全国农业劳动模范（1990年）等荣誉称号 ，自1991年起享受国务院颁发的政府特殊津贴。 7.我们学校的院士 陈文新，女，教授，博士生导师，中科院院士，国际根瘤菌/土壤杆菌分类分委会委员。1952年毕业于武汉大学农学院土壤农化学系。1958年获前苏联季米里亚捷夫农学院副博士学位。1959年1月回国后在北京农业大学(现中国农业大学)生物学院微生物学系工作至今,一直从事土壤微生物学与细菌分类学的教学和科学研究。自二十世纪70年代起，她主持研究我国根瘤菌资源调查与分类。在她卓越的领导下，组织全国20个单位的微生物学工作者，共同完成全国32个省（市）700多个县，不同生态条件下各种豆科植物根瘤菌资源调查，保藏根瘤菌5000多株；对其中2000株进行过100多项性状分析；发现一批抗逆性很强的根瘤菌种质资源；发表根瘤菌新属2个，新种12个，在国际根瘤菌属、种系统中占很大比重；从分类学角度获得豆科植物与根瘤菌共生关系的新认识；在国内外学术刊物上发表论文100多篇，其中近20篇被SCI收录，被引用200多次；培养硕士、博士50多人。她先后获农业部部级科技进步一等奖2项，获国家教委科技进步二等奖2项，获农业部优秀教材一等奖1项，2001年获国家自然科学二等奖1项。她的工作在国际上有较大影响，1996年当选为国际根瘤菌/土壤杆菌分类分委会委员, 1998年被邀与美国学者一道撰写“伯杰系统细菌学手册”第二版根瘤菌部分内容。现在她正热心于将优良豆科植物--根瘤菌共生体系引入我国西部大开发的农林牧业中而努力工作着。

我们所-中国科学院南京地理与湖泊研究所的导师：1. 孔繁翔..... 男， 1957 年生，教授， 博士生导师 专业及研究方向： 湖泊生态学，环境生物学，生态毒理学 电子信箱：， 简历： 江苏海安县人， 1982 年南京大学生物学系毕业，获学士学位。 1987 年在中国科学院水生生物研究所获硕士学位。 1987 年后历任南京大学环境学院讲师，、副教授和教授。 1996 年起任南京大学环境学院副院长。曾任国家教育部环境科学教学指导委员会环境生物学专业委员会秘书。 2002 年入选中国科学院“百人计划”，到中科院南京地理与湖泊研究所太湖湖泊生态系统研究站工作，现任中科院湖泊沉积与环境重点实验室副主任。现为中国生态学会污染生态学专业委员会副主任。主编专著《环境生物学》、共同主编《生态毒理学》和《环境科学与工程应用辞典》副主编，参加编写《生态学》，发表论文 50 多篇，其 SCI 论文 20 篇。作为主持人， 2000 年获江苏省高等教育成果奖一等奖。 2.高光..... 男，1964年6月生，理学博士，副研究员 专业及研究方向：微生物学、湖沼学、湖泊微生物生态学 电子信箱： 简历： 1987年毕业于厦门大学生物系微生物学专业，获学士学位；1993年在中国科学院南京地理与湖泊研究所，环境生态学方向毕业，获理学硕士学位。1987进入中国科学院南京地理与湖泊研究所工作，1998被聘为副研究员。主要的研究方向：湖泊微生物生态学，尤其是微食物网的结构、功能及其在湖泊物质循环过程中的作用的研究。目前主要围绕着浅水湖泊富营养化机理及生态系统对富营养化的响应、蓝藻水华暴发机制等，研究磷在湖泊环境各介质中的分布、有效利用形式、迁移转化的途径、速率、影响因子、以及微生物、酶等在此过程中的作用等。 3. 吴庆龙.......... 男， 1967 年生，副研究员， 硕士生导师 专业及研究方向： 微生物分子生态学、环境微生物学、湖沼学、恢复生态学等 电子信箱： 简历： 江苏六合县人， 1996 年毕业于南京大学，获理学硕士学位，方向为环境生物学； 2002 年毕业于中国科学院研究生院，获理学博士学位，方向为湖泊生态学； 2005 年毕业于奥地利萨尔斯堡大学，获自然科学博士，方向为微生物（分子）生态学。 1987 年以来在中国科学院南京地理与湖泊研究所先后任职实习研究员、助理研究员和副研究员， 2005 年 3-12 月兼任奥地利科学院湖沼学研究所客座研究人员。研究兴趣主要包括水域微生物分子生态学、环境微生物学、湖泊生态学及恢复生态学。在应用与环境微生物学（美国）等国内外核心期刊上发表论文 50 余篇，其中 SCI 源刊物上的论文 10 余篇，并被引用 40 多次。作为主要研究人员，曾获得农业部科技进步二等奖。与欧洲的相关研究机构保持良好的合作关系， 1999 年以来先后多次赴奥地利、德国、捷克、荷兰等国家进行学术交流和访问，现为美国海洋湖沼学会、美国微生物学会和国际微生物生态学会的会员，并参与应用与环境微生物学（美国）等学术期刊稿件的审阅。

药学毕业论文开题报告篇3 题 目 名 称： 番泻叶对小鼠尿量的影响 研究现状： 一、普鲁兰酶 普鲁兰酶(Pullulanase，. 2. 1. 41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶还可以分解普鲁兰多糖，普鲁兰酶来源于微生物，R-酶则来源于植物。普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌Aerobacter. aerogenes}(典型菌为肺炎克雷伯氏杆)发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能。之后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。 在淀粉加工工业中，α淀粉酶最为常用，它的功能是水解淀粉的α-1,4糖苷键，单独用它时，产物中含有大量分支结构的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷键。假如不把淀粉的α-1,6糖苷键彻底分解的话，势必会造成很大的浪费。自然界中，存在有能分解淀粉的α-1,6糖苷键的酶，通称为解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( , Oligo-l,6-glucosidase )，普鲁兰酶( )，异淀粉酶( , Isoamylose )，支链淀粉一6-葡聚糖酶( )，其中普鲁兰酶要求的底物分子结构最小，故而可以将最小单位的支链分解，导致可以最大限度的利用淀粉，所以在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。故而许多国家都争相开发，但是到现在为止，只有丹麦的NOVO公司具有普鲁兰酶的生产能力。我国只有向其进口，但是其价格昂贵，限制了普鲁兰酶在我国的应用。其实，我国早在七十年代就开发普鲁兰酶的产生菌，但是该菌的酶学性质不适合生产，至今我国在普鲁兰酶的国产化方面还没有报道。 在淀粉的加工行业上，对普鲁兰酶的酶学性质的要求是耐酸耐热，其原因是因为通常使用外加酶化法，由于所用酶类的限制，普鲁兰酶的添加可以在两步反应的任何一步，但必须满足上述的反应的条件。因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热。 二、普鲁兰酶的研究现状 1.产普鲁兰酶的微生物 普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气杆菌(Aerobacter aerogenes)发酵获得。他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入的研究，从不同的地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。但是迄今为止，尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件(酸性，温度)，大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。以下便介绍一下普鲁兰酶的生产菌种。 蜡状芽抱杆菌覃状变种(Bacillus cereus ) 由日本的ToshiyukiTakasaki于1975年发现。该菌同时产生两种淀粉酶:β-淀粉酶和普鲁兰酶。最佳作用条件为pH6～，温度50℃，最大转化率(淀粉水解产生麦芽糖)大约为95%.酶学研究中发现，此酶在pH5，温度60℃依然保持大部分活性，该菌的营养细胞呈棒杆状，聚集成长短不等紊乱链状，无运动性，格兰氏阳性，产芽抱时细胞无明显膨胀。该菌最适生长温度30℃～37℃ ,最高生长温度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，海藻糖，淀粉和糖原。 嗜酸性分解普鲁兰多糖芽抱杆菌() 上世纪八十年代初，丹麦Novo公司获得此菌，此菌所生产的普鲁兰酶耐热 (60℃)，耐酸()。该公司经过投入巨资开发研究，1983年Nov。公司在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名Prornozyme。如今，它是应用最广，产量最大的普鲁兰酶。呈棒状，深层发酵几小时后，可观察到类原生质体的膨胀细胞，较稳定，饱子呈圆柱体或椭圆体。格兰氏反应阳性，37℃生长良好，45℃以上和pI-1高于以上不长，在以普鲁兰糖为碳源的培养基(( ～)上生长良好。 枯草芽饱杆菌(Bacillus subtilis) 1986年，日本的Yushiyuki Takasaki报道了一株能产生耐热耐酸普鲁兰酶的菌种，被命名为Bacillus subtilis TU。此菌种所产生的酶为普鲁兰酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽搪.水解普鲁兰糖为麦芽三糖，其中普鲁兰酶最佳作用pH为～，但在时亦有约50%的酶活，此普鲁兰酶最佳作用温度60℃。 耐热产硫梭菌(Clostridum Themosulfurogenes) 1987年.德国的等报道了一株能同时产a淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种:耐热产硫梭菌。该菌种所产普鲁兰酶有较广的温度适应范围(40℃～85℃)，在～有较高的活性，在如此广的范围内都有较强活力无疑将扩大该普鲁兰酶的应用领域. Bacillusnaganoensis,Bacillus deramificans, 上世纪九十年代，Deweer发现了普鲁兰酶产生菌Bacillus naganoensis;Tomimura筛选出Bacillus deramifrcans。这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与Bacillus. Acidopullulyticus的酶学性质相似。这两株菌都是中度嗜酸菌，在以上就不生长，温度超过45℃以上同样也不生长。这两株普鲁兰酶产生菌的发现，进一步拓宽了普鲁兰酶的应用。 产普鲁兰酶的高温菌菌种 自上世纪八十年代以来，人们逐渐意识到在通常的自然条件下，很难筛选得到极端耐热的普鲁兰酶生产菌种，于是各国的科学家便把目光转移到温泉嗜高温细菌的筛选，而且现在已经取得较多的成果。Bacillus如vorcaldarius所产普鲁兰酶的最适温度和pH分别是75～85℃, , Thermotoga maritime的最适温度和pH分别是90℃, , Thermurs caldopHilus的最适温度和pH分别是75℃,, Fenidobacterion pernnavoran最适温度和pH分别是80～85℃, 2.普鲁兰酶的分子结构 至今为止，许多普鲁兰酶的基因己经被克隆，但是还没有见到任何有关普鲁兰酶结构的报道，但是在根据序列相似性对糖普键水解酶的分类，普鲁兰酶属于第13家族，α淀粉酶家族，这个家族中包含了30多种酶，可以分为水解酶，转移酶。异构酶三大类。这些酶能够水解和合成α～,α～,α～,α～,α～,α～糖苷键。其中很多酶的结构已经被报道，它们都采取了(β/α)8的结构，通过生物信息学的研究，这个家族的蛋白都有一个共同的结构，酶的活性中心都是(β/α)8折叠筒的结构，命名为结构域A。第13家族的大多数酶还具有结构域B，它是位于(β/α)8折叠筒中，第三个β片层与第三个α螺旋之间的一段序列，其特点是结构和长度差异较大，推测其功能是与底物的结合有关。在紧接着(β/α)8折叠筒后，还有C结构域，紧接C结构域，部分家族成员还有结构域D。 3.普鲁兰酶的应用 普鲁兰酶，在食品工业中是一种用途广泛的酶制剂和加工助剂。它能专一性分解淀粉中的支链淀粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷键，使分支结构断裂，形成长短不一的直链淀粉。因此，将该酶与 其它 淀粉酶配合使用时，可使淀粉糖化完全。近年来，普鲁兰酶己作为淀粉酶类中的一个新酶种，应用于淀粉为原料的食品等工业部门，在食品工业中有如下几方面的作用: 单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉 直链淀粉具有凝结成块，易形成结构稳定的凝胶的特性，因此，可作为强韧的食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，又因涂布开展性好，故适合于作为食品的保护层。它还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用于装油脂含量高的食品，以防止油的渗出以及肉食品加工。近年来在食品工业中提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些方面具有较大的发展前途。豆类直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性比其它淀粉好，如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉，再制成直链淀粉后，可以制成高质量的粉丝。一般谷物淀粉中，直链淀粉含量仅占20%，支链淀粉含量约为80%。工业上每生产1吨直链淀粉就有4吨副产品的支链淀粉。美国虽然通过遗传育种的方法.得到含直链淀粉60%玉米新品种，但不大适于大量生产。国外已采用普鲁兰酶改变淀粉结构，可使支链淀粉变为直链淀粉。据报道，采用此法收率可达100%.制造直链淀粉的方法为，先采用普鲁兰酶分解经液化的分支部分，使其转变为直链淀粉，并以丁醇或缓慢冷却法沉淀淀粉。再回收含少量水分的晶型沉淀物，最后通过低温喷雾干燥法制成粉状的直链淀粉。 普鲁兰酶与β～淀粉酶配合使用生产麦芽搪 饴糖是我国传统的淀粉糖产品，其中所含部分麦芽糖，广泛用于糖果、糕点等食品工业。目前生产方法是以α～淀粉酶进行液化，再用β～淀粉酶水解支链淀粉，这样只能水解侧链部分。接近交叉地位的α～糖苷键时，水解反应停止。但如果使用普鲁兰酶共同水解，便能使分支断裂，提高淀粉酶水解程度，降低了β极限糊精的含量，大大提高了麦芽糖的产率，有利于生产麦芽搪浆。目前对加普鲁兰酶进行糖化己作了较大规模的试验。 试验条件为。每批投料量约为900公斤碎米，粉浆浓度为15～16Be°数皮用量(对碎米计)，β～淀粉酶活性2,000单位/克以上，;普鲁兰酶活性45,000～55,0 00单位/克，系由产气气杆菌生产，每批用量为1公斤。试验结果表明，加入普鲁兰酶糖化的试验糖与对照糖品相比，还原糖平均增加，麦芽糖含量平均增加了，糊精含量平均减少了高浓度麦芽糖浆较之高浓度葡萄搪浆，具有不易结晶，吸湿性小的特点，所以高浓度麦芽糖浆在食品工业中有着广泛的用途。采用普鲁兰酶与p一淀粉酶配合使用，成本低廉，麦芽糖收率达到70%左右，其至更高。 用于啤酒外加酶法糖化 啤酒生产中麦芽，既是酿造啤酒的主要原料，也为酿造过程提供了丰富的酶源。在啤酒酿造的糖化过程中，麦芽中分解淀粉的主要酶是α～淀粉酶、β～淀粉酶和分解淀粉α～1. 6糖瞥键的R一酶(植物普鲁兰酶或植物茁霉多糖酶)。β～淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用，可使淀粉分解成麦芽糖(也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麦芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化，即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进行搪化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加a一淀粉酶和分解α～糖苷键的普鲁兰酶制剂等。单独使用a一淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三搪是很不完全的。假如分解淀粉α～糖苷键的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解α～和α～糖苷键的糖化型淀粉酶，则其反应产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与α～淀粉酶协同，效果良好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。采用外加酶法糖化时，加入酶制剂的用量为:淀粉酶6～7单位/克大麦及大米:蛋白酶，60-80单位/克，并配合以菠萝蛋白酶10ppm，普鲁兰酶50单位/克大麦。以上三种酶制剂均添加于糖化或酒化开始。 总之，普鲁兰酶无论作为酶制剂和食品工业的加工助剂均有广阔的发展前途。 研究目的和意义： 酶制剂工业是上世纪七十年代就己经形成的一个重要的产业，目前世界酶制剂总产值达100亿美元，我国的产值约为100亿人民币，并且随着其应用领域的不断扩大以及新酶种的开发，这一市场正在迅猛发展。但是全球酶制剂产业几乎被几家外国公司所垄断，其中丹麦的NOVO公司几乎占全球总销售额的一半。本研究对普鲁兰酶的开发，对酶制剂产业的发展有重要的意义。 其次我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但是所开发得到的普鲁兰酶，既不耐热也不耐酸，这就使其在工业化应用中受到了局限。为了改变我国对进口产品的依赖，填补我国这一领域的空白，寻找一条国产化的道路，本研究的目的是利用自然微生物资源，普鲁兰酶，提高我国淀粉原料的利用率，从而提高整个淀粉加工行业的生产率，这对我国淀粉加工产业的意义是不言而喻的。 研究内容(内容、结构框架以及重点、难点)： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集; (2)菌种初筛; (3)菌种复筛; (4)菌种保藏方法; (5)酶活力测定方法的建立。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响; (2)初始PH对发酵产酶的影响; (3)接种量对发酵产酶的影响; (4)发酵温度对产酶的影响; (5)金属离子对产酶的影响。 重点或关键技术： (1)纯菌株的分离; (2)菌株的鉴定方法的选择。 研究方法、手段： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集：选择适合产生的地点(面粉厂.菜地.果园等)采集土样 (2)菌种初筛：在采集的土样用无菌水稀释后，在含有淀粉类的培养基中做平板涂步， 37℃培养48h后，用碘液进行显色反应，将有淀粉酶产生的菌落接于斜面中保存。 (3)菌种复筛：将前期分离的能产生淀粉酶的菌株涂步于普鲁兰糖平板上，37℃培养48h后用95%乙醇进行透明圈实验。有透明圈产生说明菌株产生普鲁兰酶，将产生透明圈的菌落挑于斜面培养基培养。 (4)菌种保藏方法： 采用4℃低温保藏。 (5)酶活力测定方法的建立：采用发酵培养液经过离心后利用DNS显色法 520nm测定吸光值，测定标准葡萄糖标准曲线，利用标准曲线计算普鲁兰酶酶活大小。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响：采用不同碳源，氮源培养基培养一段时间，测定酶活力。(其他条件相同：接种量，装瓶量，初始PH值，转速，培养时间。) (2)初始PH对发酵产酶的影响：采用相同发酵培养基，在不同初始PH下接种等量种子液。在相同条件下培养，测定发酵液的酶活。(其他条件相同：接种量，装瓶量，转速，最佳培养温度，最佳培养时间。) (3)接种量对发酵产酶的影响：在发酵培养基中分别接入2%，4%，6%，8%， 10%，14%，18%的种子培养液于最佳碳源，氮源，最佳初始PH的培养基中，在相同条件下培养，分别检测酶活。(采用以上确定的最佳碳源，氮源，最佳初始PH。) (4)发酵温度对产酶的影响：采用相同培养基，在不同温度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培养一定时间，测定酶活力。 (5)金属离子对产酶的影响：在基础培养基中加入少量不同金属离子，发酵后测酶活。(金属离子有： 锰离子，钙离子，锌离子，镁离子，铁离子，铜离子。) 研究进度 ：完成项目总体进度30%，样品土样的采集及前期的准备工作,菌株的初筛，包括(样品土样原液的涂步培养及摇床培养，产支链淀粉酶菌株的挑选及斜面培养)。 ：完成项目总体进度50%,菌株的复筛，包括(产普鲁兰酶菌株的筛选及斜面培养),葡萄糖标准曲线的测定,酶活测定方法的建立,并以酶活大小对菌株进行再次筛选。 ：完成项目总体进度80%,产酶条件的研究。包括：碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。并通过各中单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。 2009、4—2009、5 ：完成项目总体进度100%,课题总结，撰写论文。 文献综述(包括：国内外研究理论、研究方法、进展情况、存在问题、参考依据等) 自从1961年Bender H.等人在研究一株产气气杆菌Aerobacter aerogenes(典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌)时首次发现普鲁兰酶后，国际上对产生这种酶的微生物进行了广泛研究，发现许多微生物可以产生此酶，并筛选出一些适用于工业化生产的优良菌株。随着该酶的应用发展，对耐热性普鲁兰酶的研究也逐渐增多，已成功克隆并表达了该酶的基因。国内1976年开始对一株产气气杆菌(Aerobacteraerogenes 10016)的普鲁兰酶进行研究，对该菌株的产酶条件、酶的分离提取及酶学性质作了报道，并研究了该酶的食品级提取技术。此外，陈朝银、刘涛等人从云南温泉水样中筛选到一株产普鲁兰酶高温栖热菌菌株，通过诱导等实验将该酶的酶活从提高到170u/mL，酶产量提高了近2500倍左右，酶的最适作用温度及pH分别是75℃和，具有一定的耐热和耐酸特性。 陈金全等从温泉水样中筛选到一株产耐热耐酸普鲁兰酶的野生菌株，并根据形态、生理生化特征、细胞化学组分分析及16SrDNA序列比对、基因组DNA的G+C摩尔百分含量、同源性比对等实验，鉴定其为脂环酸芽抱杆菌属(Alicyclobacillus)的一个新种，所产酶最适作用温度为60℃，最适pH值，具有较好的耐热耐酸特性。杨云娟等利用毕赤酵母成功构建了普鲁兰酶表达量较高的基因工程菌，摇瓶发酵酶活可达，最佳发酵条件下产量可达 .酶的最适作用温度为600C，最适pH值，具有较好的耐热耐酸性。目前我国仍没有具备独立生产普鲁兰酶能力的厂商，要实现低成本、国产化的生产，还有很长的路要走。 技术应用于耐热脱支酶的研究，使耐热异淀粉酶的研究有了很大发展。Coleman等人将嗜热厌氧菌T. brockii普鲁兰酶基因克隆到中得到的克隆子分泌的普鲁兰酶数量高于出发菌株，Okada等人将Bacillus Steanther, onhiu:中编码热稳定异淀粉酶的基因克隆到:中，得到的转化菌株其异淀粉酶能在60 ℃稳定15分钟。Burchadf将。ostridium thermosulf urogenes DSM38%的嗜热异淀粉酶基因克隆并在中表达，所得酶的最适pH和最适温度与出发菌相同，而且在高温下仍能保持活性.Antranikiam等人将Pyrococcus舟riousous的异淀粉酶基因克隆到中并分离得到了酶蛋白。尽管如此，目前尚未有已将转基因的耐热性异淀粉酶工程菌应用到工业生产中的报道。众所周知，利用物理和化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞是选育高产变种菌株行之有效的经典方法，它在为培育多种抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高产变种菌株方面曾经起过极为重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。 主要参考文献： [1][美]惠斯特勒等编王雏文等译.淀粉的化学与工艺学[M].北京：中国食品出版社，1988 [2]张树政.酶制剂工业[M]. 北京: 科学出版社，1998 [3]邬显章.酶的工业生产技术[M]. 吉林: 吉林科学技术出版社，1988 [4]Taniguchi H, Sakano Y, Ohnishi M, Okada G(1985) Pullulanase[J].TanpakushitsuKakusan Koso. 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