质粒提取及纯化研究论文

不知道楼主你说的对照组，做的是阳性对照，还是阴性对照呢？如果这个不说清楚，是没法回答你的问题。假设，你说的对照是阴性对照的话，首先第一个，1，这个结果就是不对的，对照组出现菌落，说明你的抗生素失效了，实验无效。2.的话说明你的转化没有成功，实验操作跟试剂没问题3.实验成功，可以挑取单克隆摇菌假设你说的对照组做的阳性对照那么1.实验成功，可以进入下一步2.试剂或者操作有问题，导致阳性对照都做不出来3.这个实验结果没法接受，不合常理，重新再转化另外，一般做转化，会正反对照都做，阳性对照+阴性对照。

传统的质粒提取方法前面人已经回答挺全了，现在实验室讲究效率，很多都直接使用试剂盒的，例如BIOG的质粒提取试剂盒，有小量、中量的、高纯的，还有专门去内毒素的等等，可以满足大部分实验需求。

本文主要以OMEGA试剂盒（产品编号#D6950）为例，讲述下提质粒（去内毒素）的注意事项。 DNA在化学性质上是懒惰的，但是在物理结构上是易碎的。因为在化学上其潜在的反应基团隐藏在中央螺旋部位，并经氢键紧密连接，同时碱基外侧受磷酸键和戊糖形成的强大环层的保护，这种保护因内在的碱基堆积力而进一步加强；在物理上，其长而弯曲，侧面不稳定，更容易受到柔和剪切力的破坏。双链DNA在溶液中随机卷曲，并由于碱基之间的堆积作用和DNA骨架上磷酸基团之间的静电排斥力而变得粘稠，所以在移液、震荡或搅拌引起的液流中，在粘滞的盘绕物上产生的拖拉力，很容易切断双链DNA。DNA越长，破坏其所需的力越小，大于150kb的DNA分子在常规分离基因组DNA过程中易于断裂。 一般DNA分离提纯可以简单分为三步： 裂解宿主细胞。如， 离子去污剂，如SDS 从细胞中释放DNA，去除与DNA结合的蛋白质并快速使胞内核酸酶失活。如， 酶水解蛋白和RNA 层析液中吸收、释放DNA 利用乙醇或者异丙醇沉淀DNA去除盐离子。 菌液在高PH条件下，加入强离子去污剂（如，SDS）能够破坏细胞壁，是蛋白质与染色体DNA变形，并将质粒DNA释放到上清液中。但是在实验中关键是动作要快，因为长时间暴露在变形条件下会对闭环DNA造成不可逆性。这种变性的折叠卷曲DNA不容易被限制性内切酶切割，它的琼脂糖电泳速率是线形、超螺旋和环状等天然结构DNA电泳速率的2倍，并且不容易被嵌入染料染色。碱裂法在制备治理过程中常会产生不同数量折叠形式的DNA。上述这种方法适用于15kby以下的质粒，大于15kb的质粒在提取过程中很容易断裂，可用等渗蔗糖溶液裂解细菌，并用溶菌酶和EDTA（乙二胺四乙酸）去除细胞壁，可解决受损。产生的原生质球可通过加入去污剂（如SDS）被裂解。 试剂盒一般采用DNA选择性吸附稳定固相（通常是二氧化硅或者硅酸盐）的特性进行DNA纯化。在高PH、高盐缓冲液中，DNA会吸附到二氧化硅介质上面，在低盐浓度下可被洗脱下来。玻璃表面的阳性粒子随后可以在DNA骨架中磷酸负电基团和硅醇负电基团（Si-OH）之间形成盐桥，结合强度与成桥离子类型有关。一旦DNA与介质结合，他就会与其他的生物多聚物（如RNA和糖）分开。得率由DNA大小决定，片段越小，与二氧化硅结合越紧密，得率越低。 实验开始前，最主要的是细菌培养。试剂说明书建议使用DH5α，DH1，C600，都可以，XL1-Blue虽然长 的很慢但是也可以使用。其次培养基的使用建议采用LB培养基，其他的均不建议。 开始细菌培养前，最好涂板调菌培养，这样可以保持菌的活性，甘油保存的菌可能会产量低或者质粒丢失。 当挑取单菌落后放入37℃，300rpm，培养12~16h。 为了获得最佳质粒产率，起始培养体积应基于培养细菌密度。 建议使用OD600的和之间的细菌提取质粒。 使用富含营养素的介质时，应注意确保细菌密度不超过的OD600，最后菌液OD600为。 在推荐的OD范围之外使用高密度培养可能会超过纯化体系。 注意： 曝气是很重要的，LB培养基的体积应该是容器的1/4 随着培养时间的加长，由于细菌的死亡和裂解，DNA的产量开始下降。

质粒的抽提与纯化实质上是将质粒DNA与细菌的基因组染色体DNA、RNA、蛋白质、细胞膜等细 胞器及其他大分子物质分离的过程，因此质粒的抽提大致可分为：细菌的培养、收集与裂解；质粒DNA 的分离与纯化；浓度、纯度的鉴定三个过程。 ①染色体DNA的去除 ：在富集培养目标菌种后，首先应裂解细菌细胞，采用含有SDS的NaOH溶液裂解菌体释放质粒，同时氢氧化钠的强碱性，可使DNA氢键断裂，双螺旋结构破坏而变性，再加入中和缓冲液，可使部分变性的质粒DNA复性，而染色体DNA不复性，因此使质粒DNA与染色体 DNA分离开。 ②细菌中的RNA可以通过RNaseA去除 ③蛋白质的去除 ：细菌中的蛋白质可以通过酚/氯仿/异戊醇抽提，酚可以使蛋白质变性，氯仿将微溶 于水的酚抽提到有机相中，使其与水相中的DNA分离。分离后的质粒DNA可以通过乙醇回收，乙醇可以消除核酸水化层，暴露其带负电的磷酸基团，因 此在阳离子充足的环境中可以发生”核酸–乙醇沉淀 ④蛋白质、染色体DNA、细胞碎片、以及在分离过程中与试剂形成的不溶复合物都可以通过离心去除。 ⑤试剂盒法DNA的回收 :除碱裂解法以外，还可以通过试剂盒抽提质粒DNA，在碱裂解进行变性和复性后的纯化回收通过纯化柱进行。纯化柱中的硅胶膜能在高盐、低PH条件下吸附体系中的 DNA，将其与其他杂志分离，而在低盐、高PH条件下DNA又可以被洗脱下来。 ⑥纯化后的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计鉴定 电泳法 ：带负电荷的DNA分子在外加电场的作用下向正极泳动，不同分子量大小与构型的DNA分子泳动速率不同，因此可以在琼脂糖凝胶上呈现不同的条带。在凝胶中加入核酸染料可以方便我们观察，因为核酸染料可以嵌入到DNA碱基之间，避免被凝胶中的氢离子淬灭，因而亮度更高。 紫外分光光度法 ：DNA的吸收峰在260nm处，蛋白的吸收峰在280nm处，因此可以用OD260/OD280判断DNA纯度，一般认为比值在之间时，纯度较高 材料： 含有pSK II质粒的大肠杆菌菌株的菌液、含有MP3质粒的大肠杆菌菌株的菌液 试剂： ①细菌的培养：LB培养基、氨苄青霉素 ②细菌的裂解与收集：溶液I（Tris-HCl、EDTA、Glucose）、溶液II（NaOH、SDS）、溶液 III（KOAc、CH3COOH）、RNAseA③质粒DNA的分离与纯化：酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、70%乙醇、1XTE溶液（Tris-HCl、 EDTA）、东盛生物小提质粒盒④电泳：琼脂糖、电泳缓冲液、StarGreen DNA Dye、loading buffer、1XTE buffer①细菌的培养： 将含有pSK II和MP3质粒的大肠杆菌菌液分别于LB培养基上划线 → 37℃过夜培养 → 挑取培养基上的单菌落于液体LB培养基中，震荡培养过夜②细菌的收集与裂解 - 碱裂解法 吸取菌液12000rpm离心1min (沉淀菌体)↓弃上清培养液 (完成细菌的收集)↓加入150ul溶液I和3ul RNaseA，震荡混匀，静置2min (悬浮菌体、去除RNA)↓加入250ul溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮(不超过5min。裂解菌体、释放质粒，此步骤动作轻柔，防止基因组DNA断裂，且时间不宜过长)↓加入180ul溶液III，颠倒混匀，冰浴10min （中和反应，防止基因组DNA污染）↓12000rpm离心5min，吸取上清80ul，重复此操作 (此时已完成了染色体DNA、RNA、细胞碎片、部分 蛋白质的分离)③质粒DNA的分离 加入53ul的酚/氯仿/异戊醇上下颠倒抽提10min，静置分层 （DNA在水相中），12000rpm 离心10min↓通风橱中吸取上清，加入20体积的无水乙醇 （发生核酸-乙醇沉淀）↓12000rpm离心5min,倒掉乙醇，短暂离心10s，用移液枪吸取乙醇↓加入500ul 70％乙醇洗涤DNA沉淀，离心5min，倒掉乙醇，离心10s，用移液枪吸取乙醇，将其放置在通风橱中促进乙醇挥发↓加入300ul 1XTE溶解，65℃热板温育10min④纯化质粒DNA 加入1XTE使溶液为300ul，加入300ul酚/氯仿，充分震荡抽提5min(去除蛋白)↓12000rpm离心5min，吸取上清↓加入1/10体积3M NaAc和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀↓置于-70℃冰箱15min沉淀DNA↓4℃12000rpm离心15min，倒掉乙醇，离心10s，用移液枪吸去乙醇↓ 70%乙醇洗DNA沉淀一次，离心2min，倒掉乙醇 （去除DNA中的盐离子）↓离心10s，移液枪吸去乙醇，在50-60℃热板上烘干1min↓加入20ul 1XTE溶解DNA沉淀，并在65℃热板上温育10min （使DNase失活） -试剂盒抽提法 加入溶液III离心后的上清液置于DNA纯化柱中，静置2min↓12000rpm离心1min，弃滤液 （DNA被吸附到硅胶膜上）↓加入500ul溶液PB，12000rpm离心1min，弃滤液 （洗脱蛋白、盐等杂质）↓加入500ul溶液W，12000rpm离心1min，弃滤液 （重复此步骤一次，洗掉多余盐离子及乙醇）↓12000rpm离心3min （彻底去除纯化柱中残留的液体）↓将DNA纯化柱置于新的离心管中，向纯化柱中央处悬空滴加80ul溶液Eluent，室温静置2min （将硅胶吸附柱上的质粒DNA洗脱下来）↓12000rpm离心1min （管底即为质粒DNA）⑤琼脂糖凝胶电泳观察 制胶： 称取琼脂糖加入盛100ml 电泳缓冲液的250ml 三角瓶中，摇匀↓微波炉加热至琼脂糖溶解（沸腾）↓放在冷水中冷却，加入10ul的StarGreen DNA Dye，摇匀↓琼脂糖倒入模具中，插上梳子 。凝固后向上垂直拔出梳子，将凝胶转移到电泳槽中，加入电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1mm点样： 按照碱裂解法纯化前的MP3、pSK II样品各3ul、5ul Marker（10ug/ul、20ug/ul、60ug/ul）、碱裂解法纯化后的MP3、pSK II样品各6ul，试剂盒提取的MP3、pSK II样品各2ul的顺序依次加入点样板小孔中，再分别加入10Xloading buffer，配置10ul点样体系，吹吸混匀电泳： 打开电源开关，调节电压3-5V/cm观察： 将电泳好的凝胶置于凝胶成像仪中观察

质粒抽提方法即去除 RNA，将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。实验原理提取质粒DNA的方法有很多种，从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取，从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取，从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等，各种不同的方法各有其优缺点，根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。详细内容请参考《分子克隆实验指南》。[1] 另外，复旦大学生化与分子生物学实验室一篇文章，提供了质粒提取机理的详细解说。碱裂解法人们使用碱与SDS裂解法从E. coli（大肠杆菌）中分离制备质粒DNA已有30多年的历史。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。只要OH-处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na+时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。在SDS存在的条件下，碱水解是一项非常灵活的技术，它对E. coli的所有菌株都适用，并且其细菌培养物的体积可以从1-500mL以上。煮沸法煮沸法是将细菌悬浮于含有Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细菌外壁，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是。闭环质粒DNA链彼此不会分离，这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构。当温度下降后，闭环DNA的碱基又各就各位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体DNA和蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取少至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。但对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不推荐使用该法。这是因为碳水化合物很难除去，会抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙锭梯度离心中会使超螺旋质粒DNA带变得模糊不清。大肠杆菌菌株HBl01及其衍生菌株（其中包括TGl）能产生大量的碳水化合物，不适于用煮沸法裂解。质粒小提试剂盒用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，它结合了优化的碱裂解法，以及方便快捷的硅膜离心技术，具有高效，快捷的特点，能在30min内完成全部操作。利用试剂盒能从1-5mL过夜培养的大肠杆菌菌液中纯化得到10-40μg高质量的质粒DNA（OD260/OD280=），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析，各种酶促反应，PCR以及部分细胞系的转染等。