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植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以可溶性糖和淀粉的含量作为重要指标，本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法。（一）苯酚法测定可溶性糖【实验原理】植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10－100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。【实验仪器及试剂】1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。2．试剂：（1）90％苯酚溶液：称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。（2）9％苯酚溶液：取3mL 90％苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。（3）浓硫酸（比重1.84）。（4）1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。（5）100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。【实验步骤】1．标准曲线的制作： 取20mL刻度试管11支，从0－10分别编号，按表27－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以 5－20s。加入5 mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8 mL，在恒温下放置30min。显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。2．可溶性糖的提取 取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10－0.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。3．测定吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。式中：C一标准方程求得糖量（ug）α一吸取样品液体积（mL）V－提取液量（mL）n一稀释倍数W一组织重量（g） （二） 蒽酮法测定可溶性糖【实验原理】糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应X 所以用愈酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用意酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与意酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为630nm，故在此波长下进行比色。【实验仪器及试剂】1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20ml刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。2．试剂：（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50mL乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数周，如有结晶析出，可微热溶解。（2）浓硫酸（比重1.84）【实验步骤】1．标准曲线的制作：按方法一标准曲线的制作方法加入标准的蔗糖溶液，然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管准确保温1min取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，以光密度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出标准线性方程。2．可溶性糖的提取同方法一第二步。3．显色测定：吸取样品提取液0.5mL于20mL刻度试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，以下步骤与标准曲线测定相同，测定样品的光密度。4．计算可溶性糖的含量，计算公式同方法一。 Copyright 北京农学院生物技术系 All Rights Reserved!
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蒽酮比色法测定可溶性糖如下：
一、实验目的
1、掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。
2、学习植物可溶性糖的提取方法。
二、实验原理
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，因此可以用于糖的定量测定。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为620nm。
三、实验材料
任何植物鲜样或干样。
四、药品试剂
1、80%乙醇。
2、葡萄糖标准溶液（100μg/ml）：准确称取100mg分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100ml，使用时再稀释10倍（100μg/ml）。
3、蒽酮试剂：称取1g葱酮，溶于80%浓硫酸（将98%浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中）1000mI中，冷却至室温，储于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用2~3周。
五、实验器材
分光光度计、分析天平、离心管、离心机、恒温水浴、试管、三角瓶、移液管、剪叨瓷盘、玻棒、水浴锅、电炉、漏斗、滤纸。
六、实验方法
1、样品中可溶性糖的提取：称取剪碎混匀的新鲜样品零点五到一克，放入大试管中，加入15 ml蒸馏水，在沸水浴中煮沸20分钟，取出冷却，过滤入100 ml容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。
2、标准曲线制作：取6支大试管，从0~ 5分别编号，按表1-3加入各试剂。
注意事项
1、蒽酮试剂含有浓硫酸，使用时应小心。
2、蒽酮要全部取自同一瓶，以保证条件一致性。
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测定方法有以下几种：1.蒽酮法测定可溶性糖2.苯酚法测定可溶性糖3.3 ,5 –二硝基水杨酸比色法测定还原糖4.斐林试剂比色法测定还原糖斐林试剂比色法测定还原糖步骤一、原理 植物组织中的可溶性糖可分为还原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非还原糖（主要是蔗糖）两类。还原糖具有醛基和酮基，在碱性溶液中煮沸，能把斐林试剂中的 Cu 2+ 还原成 Cu + ，使蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比，在 590 nm 波长下比色测定吸光度，查标准曲线，即可计算出所测样品中还原糖的含量。本方法也可用于测定蔗糖及总糖含量。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 新鲜植物样品或烘干粉碎过的植物样品。（二）试剂 1. 斐林试剂 A 液： 40 g CuSO 4 · 5H 2 O 溶解于蒸馏水定容至 1000 mL 。 2. 斐林试剂 B 液： 200g 酒石酸钾钠（ KNaC 4 H 4 O 6 · 5H 2 O ）与 150g NaOH 溶于蒸馏水中，并定容至 1000 mL 。 A 、 B 两液分别贮存，使用前等体积混合。 3. 0.1 ％葡萄糖标准液：取 80 ℃下烘至恒重的葡萄糖 0.1000 g ，加蒸馏水溶解，定容至 100 mL 。 4. 0.1mol/LNaOH 。 5. 甲基红指示剂： 0.1 g 甲基红溶于 250 mL 60 ％乙醇中。 6. 10 ％ Pb(Ac) 2 。 7. 饱和 Na 2 SO 4 。（三）仪器设备 分光光度计，分析天平，离心机，水浴锅，具塞刻度试管，刻度吸管，容量瓶，研钵。 三、实验步骤 1 . 标准曲线的制作 取 7 支试管，按表 24 – 4 分别加入各溶液。 将以上各管混合后加塞，于沸水浴中加热 15 min 。取出后自来水冷却， 1500 r/min 离心 15 min 。取上清液，用分光光度计在 590 nm 波长下比色，以蒸馏水作对照，读取吸光度。用空白管的吸光度与不同浓度糖的各管的吸光度之差为横坐标，对应的糖含量为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 样品中还原糖的提取 取新鲜的植物样品洗净、擦干、剪碎，称取 3.00 g ，放入研钵中研磨至糊状，用水洗入大试管中。体积为 10 ～ 15 mL 时，加 2 ～ 3 滴甲基红指示剂，如呈红色，可用 0.1 mol/L 的 NaOH 中和至微黄色。若用风干样品，可称取干粉 3.00 g ，先在烧杯中用少量水湿润，然后用水洗入 250 mL 容量瓶中，如显酸性，可用上法中和。 将大试管置于 80 ℃的恒温水浴中保温 30 min ，其间摇动数次，以便将还原糖充分提取出来。对含蛋白质较多的样品，此间可加 10 ％ Pb(Ac) 2 ，除去蛋白质，至不再产生白色絮状沉淀时，加饱和 Na 2 SO 4 除去多余的铅离子。 30 min 后取出冷却，将提取液全部转入 100 mL 容量瓶中。定容至刻度，摇匀后过滤待测。 3. 样品测定 吸取 6 mL 待测液，加 4 mL 斐林试剂，其他操作与标准曲线相同，在 590 nm 波长下读取吸光度。以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度，在标准曲线上查出糖含量。
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