病毒性分子机制研究论文

生物化学课理论课程具有抽象难懂、反应复杂等特点。下面是我为大家整理的生物化学论文，供大家参考。

食品生物化学高效 教学 方法 探索

生物化学论文摘要

摘要 总结 了食品生物化学的高效教学方法，包括：突出专业特点，合理设置教学内容;跟踪科学发展，及时更新教学材料;增强师生互动，使用新型教学模式;提高学习兴趣，注重理论联系实际，提高授课效率，合理利用计算机和网络资源等，以供参考。

生物化学论文内容

关键词食品生物化学;高效;教学方法

中图分类号G642文献标识码A 文章 编号 1007-5739(2011)01-0027-02

生物化学是生命科学相关领域一门重要的学科基础课。它是运用化学的原理、技术和方法，结合其他学科的原理与技术来研究生命现象的科学。其课程设置的任务是培养学生用辩证的观点正确认识生命现象的本质，使学生系统地学习现代生物化学的基本理论、基本知识和掌握生物化学的基本实验技术。相对而言，食品生物化学是一门研究人与食品化学变化关系的科学，其主要研究：生物体基本成分组成、结构、性质和功能;作为食品成分的相关物质在加工、贮存等条件下的变化;食品在人体中的代谢及营养功能;食品的化学组成及结构;加工过程对食品的影响等。这门课程是食品加工、食品质量与安全、食品检验等专业必修的一门专业基础课，是各专业的主干课程之一。该课程在加强基础理论的同时强调基本技能的训练，以培养学生分析、解决问题的能力，对食品专业学生学习后续专业课程以及将来从事食品加工和贮存等方面的研究有非常重要的影响[1]。笔者通过多年的教学研究和实践，探索出了一些行之有效的教学方法，现分析如下，以供同行借鉴。

1突出专业特点，合理设置教学内容

生物化学是一门涉及知识面广、研究相当深入的科学。这门课程的学习对生物技术和生物科学专业的学生来说是个很大的挑战，而食品科学相关专业学生的生物科学相关基础更十分薄弱，其学习难度更为明显[2]。考虑到这些因素，食品生物化学的课程体系设置必须兼顾生命科学前导、生物化学基础和食品科学特色3个方面。没有前导知识，就使得学生难以接受新学科;忽视生化基础，就失去了课程根基;缺少食品科学特色，就偏离了教学目的。综合以上因素，笔者将食品生物化学理论课的总学时设置为50学时。包括绪论、碳水化合物、脂类、蛋白质、核酸化学、维生素与激素、食品色素、酶、物质代谢、能量代谢、食品成分的变化等。通过对这些章节的合理安排，基本达到了知识系统、特色突出、易吸引学生兴趣的要求，教学效果良好。

2跟踪科学发展，及时更新教学材料

生物化学一直是生命科学研究的领头羊，大多数生命科学的重大进展都属于生物化学或者以该领域为基础。本着“以人为本”的科研理念，食品生物化学的发展日新月异，已成为生物化学的一个重要分支。但新出版的教材中，最新的内容来源也是2年以前的文献，学生使用的多数为近1~2年以前出版的教材或版本。这些内容在学生实际应用时显得过于陈旧，甚至有些在实践中已经证明是错误的。因此，高校教师必须及时更新教学材料，这就需要教师努力参与科学研究、积极参加国内外有关科研或教研会议、经常去中外文数据库查阅相关文献。教师在课堂上可讲授食品生物化学研究中的新进展，同时将所讲授的内容按章节分别整理、装订，并分发给学生，以方便学生的学习。

3增强师生互动，使用新型教学模式

在我国，“教师讲，学生听”是十分传统而普遍的教学模式。但这种教学模式有着很大的弊端，造成学生“课前不预习、上课不积极、课后不复习、考前搞突击”。近些年，我国许多高校教师开始尝试提高学生主动性的主体性教学模式[3]。作者在食品生物化学的教学过程中设计并实践了这种模式，认为在模式的具体实施中应遵循3个“根据”：根据学生兴趣选择适当章节、根据学生班级大小选择实施方式、根据实际情况选择实施学时。学生的 爱好 和基础有所差异，因此在实施主体性教学时应允许学生自主选择该小组喜欢的章节。在高校，小班可能是30人左右，也可能在100人以上，针对不同的上课人数应该选择不同的实施方式。此外，考虑到我国学生的实际情况，不应该把所有课时都选择主体性模式，应该根据学生的反馈情况等适当调整课时数。

4提高学习兴趣，注意理论联系实际

食品生物化学教材中充满了概念、原理、过程和反应式等，是一门十分枯燥的课程，学生很难连续集中注意力。可将理论与实际相联系，将学生的注意力拉回课堂。例如，在讲授基因的表达调控时，可以提及“鸟类是恐龙的后裔，其外形的差异是由于恐龙的部分基因为适应环境的变化而被沉默，人类有望从改变鸟类的基因表达入手克隆出恐龙”;在讲授蛋白质定量方法时，可以联系“三聚氰胺奶粉事件”;在讲授酶时，可以联系不法牛奶厂家为逃避有关部门对其进行的青霉素超标检测，在牛奶中添加β-内酰胺酶等，这样可以有效地活跃课堂气氛并适当放松学生的紧张情绪。但是应当注意的是，要合理把握每堂课联系实际的次数和时间，不可影响课程进度和打乱课堂节奏。

5提高授课效率，合理利用 计算机和 网络资源

近些年来，计算机和互联网技术飞速 发展，科学技术已逐渐改变了人们的 工作和交流方式。计算机和其他硬件设备一起已经发展成为一种集视频、声音、文字、数据和通讯为一体的多媒体工具[4]。食品生物化学的大部分内容是从分子及亚分子层面来解析科学的奥秘，其中牵涉到大量的分子结构、化学反应、代谢过程;另一方面，这门课程的知识点多、内容抽象，若采用传统的黑板教学，对教师来说费时、费力，对学生来说则是难理解、难记录。相对而言，计算机多媒体教学具有如下优势：信息量大，直观生动，方便修改和完善等。但是在教学过程中要注意加强和学生的交流，适当掌握课堂节奏，幻灯片不可过于花哨，字数不可过多，注意与板书相结合等。

6从结果 体会抽象，重视学生实验环节

生物化学是一门十分抽象的课程。人类对生物化学研究对象的认识主要是通过科学实验来获得间接认识。针对学生开展的系统的实验课程，不 但可以使空泛的理论落到实处，而且可以培养学生的实际操作能力和科学创新能力[5]。根据河南 农业大学的实际，笔者为学生安排的实验包括：醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸、菜花(花椰菜)中DNA的提取分离，甲醛滴定法测定氨基氮，蛋白质的盐析和透析，蛋白质等电点的测定，脂肪酸价的测定，抗坏血酸含量的测定，用阳离子交换树脂摄取氯化钠，食品中灰分的测定等内容。

7综合考察学习情况，建立复合型考核体系

课程结束后的考核是教师对学生学习情况的一种评估。我国传统的考核方式一般是试卷式的笔试[6]。笔者认为针对食品生物化学这门课程，应当使用复合型的考核模式，需考虑如下几个方面：对知识点的识记情况、对知识的灵活运用与分析能力、对实验操作的掌握情况以及课堂表现等。根据这个标准并结合学校要求，笔者确定课程最终成绩的计算方法，即在总成绩中，平时成绩占30%，笔试成绩占70%。平时成绩的计分项包括：学生的出勤情况、课堂答问情况、实验操作和实验 报告 等;笔试成绩的计分项包括：结课后学生上交的学习 总结和试卷。这种考核方式以考核学生对知识的掌握为基础，综合学生多个方面的能力和表现，相对公平和公正，能够较为客观地反映学生对课程内容的掌握情况。

生物化学论文文献

[1] 赖建平，顾采琴，罗军，等.高校《食品生物化学》教学现状调查分析与思考[J].广州化工，2009，37(1)：145-146.

[2] 管骁，徐斐，李岱禧，等.食品专业生物化学教学工作中的创新与 实践[J].科技信息，2009(4)：326，328.

[3] 林鹏.《生物化学》互动式课堂教学模式的探索与实践[J].高教论坛，2008(6)：125-127.

[4] 张平平.食品生物化学多媒体课件的制作和教学中的几点体会[J].天津农学院学报，2007，14(2)：58-60.

[5] 罗建平，周建芹，姜绍通，等.改革生物化学实验教学提高学生动手能力[J].实验技术与 管理，2003，20(4)：101-104.

[6] 曾虹燕，刘跃进，张小云，等.构建工科生物化学教学体系的探索与实践[J].湘潭师范学院学报：自然科学版，2008，30(4)：173-175.

生物化学教学法新探

生物化学论文摘要

【摘 要】本文对生物化学教学方法进行了研究，研究结果表明，应用“中西结合”的方法，比较中医和生物化学两者之间的异同，可以激发学生的学习兴趣;运用先进的多媒体技术，可以帮助学生形象直观地掌握课程的重难点，并激发学生的 想象力 。

生物化学论文内容

【关键词】生物化学 教学方法 比较法 多媒体辅助教学法

【中图分类号】G712 【文献标识码】A 【文章编号】1674-4810(2011)12-0178-02

随着职业 教育 规模的不断扩大，导致一些职业学校出现学生基础参差不齐的现象。又由于生物化学主要是从分子水平揭示生命活动的规律，涉及的概念较抽象，分子结构较复杂且代谢途径错综交织，所以，学生往往觉得学习内容多而琐碎、学习难度较大。为了全面提高学生的综合素质，针对生物化学复杂且抽象的特点，确定了以“学生为主体，教师为主导”的教学模式，在此基础上，应用“中西结合”的方法，提高学生的学习兴趣;运用先进的多媒体技术，将抽象的基本概念用形象直观的形式表现出来，使学生能在短时间内掌握课程中较抽象的基本概念。

一 以比较法为基础，通过比较中医和生物化学两者之间的异同，激发学生的学习兴趣

中医有数千年的历史，是中华民族在长期的生产与生活实践中，认识生命、维护健康、战胜疾病的宝贵 经验 总结，是中国 传统 文化 的结晶。中医在长期的医疗实践中积累了丰富的防治疾病的经验，并在此基础上形成了独特的理论体系。中医属于自然科学的范畴，人们在生活中或多或少地接触到中医的有关知识，耳濡目染，对中医并不陌生。因此，在教学过程中，首先引入中医医疗常识，这些知识通俗易懂，学生易于接受。通过学生喜闻乐见的中医知识过渡到抽象的生物化学知识，这给老师引入新内容带来很大的帮助。按照生物化学这门课程的安排，可以从以下几个方面入手：

1.生物体组成的比较教法

中医认为，气、血、津、液是人体脏腑经络、形体官窍进行生理活动的物质基础，是构成人体和维持人体生命活动的基本物质。而生物化学认为蛋白质、核酸等生物大分子才是构成人体的基本物质，是生物体区别于自然界的标志。为什么会出现如此大的差异呢?因为中医是古人通过对人体自身的某些显而易见且至关重要的生命现象，如呼吸时气的出入、活动时随汗而出的蒸蒸热气等观察，产生对这些物质朴素而直观的认识。生物化学则不同，它是在科学的基础上，通过对自然界中约150多万种生物体的主要构成分析，得出蛋白质和核酸是生命的主要物质基础的精确科学理论，而且也通过对蛋白质和核酸的空间结构分析，揭示了这些大分子的结构与功能的关系，在生命活动过程中起着十分重要的作用。如催化代谢反应的酶，对代谢起调节作用的某些激素，具有免疫作用的抗体等都是蛋白质。此外，躯体的运动、肠蠕动、心肌的收缩、呼吸运动、体内某些物质的运输与储存、血液凝固、遗传信息的调控、细胞膜的通透性以及高等动物的记忆、识别功能等都与蛋白质有关。核酸则是遗传的物质基础，与遗传信息的储存、传递及表达有关，而体内蛋白质的生物合成则受核酸控制。核酸的代谢及功能的发挥又需要蛋白质的参加，所以，核酸代谢与蛋白质的生物合成密切相关。核酸代谢和蛋白质的生物合成与生物的生长、繁殖、遗传、变异等生命现象的基本过程有关。所以对其深入研究，对了解机体的免疫现象及免疫性疾病、病毒性疾病、放射病、遗传病、肿瘤、抗生素及某些药物的作用机制等有重要意义。

2.代谢方面的比较教法

中医认为，人体是以五脏为中心的整体，气、血、津、液是构成人体的基本物质，是脏腑经络等组织器官进行生理活动的物质基础，经络是运行气血，沟通表里上下的通道，六淫七情影响人体机能引起疾病。但中医的肺、脾、肾为主的水液代谢理论不能解释尿的浓缩和重吸收机制，不能反映人体代谢过程中的酸碱平衡。而生物化学能解释糖、脂类、蛋白质和核酸等物质的代谢及水、酸碱平衡的代谢，解释了尿的浓缩和重吸收机制，并且能解释各物质代谢的相互联系及调控，它们之间并非杂乱无章，而是井然有序地进行，以适应生理状态的变化，形成一整套复杂且精确的调节机制，使它们保持着动态平衡，保证了生命活动的正常进行。物质代谢的调节与生理需要保持一致的能力是在生物进化过程中逐步形成的。如果物质代谢调节发生紊乱，就会导致疾病。

3.遗传方面的比较教法

中医认为，子女是由父母的肾精决定，肾精是构成胚胎的原始物质。古人通过对生殖繁衍过程的观察和体验，认识到男女生殖之精的相结合则能产生一个新的生命个体。而生物化学则科学地论证了“种瓜得瓜，种豆得豆”及“一母生九子，九子各不同”的遗传变异经验。因为它是从蛋白质的生物合成遵循的“分子生物学的中心法则”，即DNA的复制、转录、翻译及蛋白质的合成来解释的。DNA的复制是以亲代DNA为模板合成子代DNA，将遗传信息按照碱基 配对 的原则准确地传递到子代DNA分子中。转录是以DNA分子为模板，合成与DNA某段碱基排列顺序互补的RNA分子，从而将遗传信息传递到RNA分子。翻译是以mRNA为模板，以其密码指导蛋白质生物合成。这些都精确地解释了遗传这一深奥而又复杂的自然现象。

通过以上方面的比较，让学生懂得中医和现代科学理论之间的差异，知道中医的理论是由当时的认识水平决定的，层次较低，而且其中许多随着科学和医学的发展大多已过时而不再有意义，是旧事物。而生物化学理论是建立在观察和科学实验的基础上，符合客观规律，是新事物。我们应该努力学好本课程，用新的知识来发掘中医有价值的东西，让几千年来的民族璀璨更加发光发亮，否则，我们就会落伍，这也是新一代青年肩负的重担。有了压力才有动力，从而消除学生的畏难情绪，有效地激发学生的学习兴趣及求知欲望。

二 利用多媒体辅助教学让知识“动”起来

学生学习生物化学反映的普遍问题是：生物化学内容太复杂、太抽象、太枯燥，老师费尽心思地讲解，到头来学生还是困惑不已，效果很差。有时培养起来的学习兴趣又由于某个抽象概念出现，而使得学生的学习兴趣消失殆尽。近年来，随着多媒体课件的普遍 应用， 计算机辅助教学已在改变着传统教学的统一模式。利用多媒体辅助教学，图文并茂，能将单一的文字转化成生动和多彩的画面，有逼真的三维图像和动画效果，使抽象的知识“动”起来。通过多媒体辅助教学，可以最大限度地展示生物分子的立体结构和化学变化 过程，给予学生多种感官刺激，变抽象为直观、变复杂为简明、变枯燥为生动活泼。这种教法可帮助学生形象直观地掌握课程的重难点，并激发学生的想象力。充分发挥学生的学习积极性和创造性，提高学生的学习效率，改变学生“背多分”的状况。

生物化学论文文献

[1]孙广仁主编.中国传统 医学丛书.中医基础理论[M].北京：科学出版社，1994

[2]马如骏主编.生物化学(第三版)[M].北京：人民卫生出版社，2007

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【综述】几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用翁康生 病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供参考。1 代表性差异分析法代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应的代表性差异分析法, 见表1 。111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation differenceanalysis , DNA RDA)此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用病毒核酸类型DNA RDA c DNA RDA非rRNA 序列6 核苷酸引导c DNA RDAds DNA 线状√ds DNA 环状√ss RNA polyA( + ) √ss RNA polyA( - ) 3 √ds RNA polyA( - ) √ 3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的差异部分作分离,克隆,序列分析。Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation differenceanalysis , cDNA RDA)Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. ( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNARDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序列片段。此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也是一个可选择的方法。114 抑制消减杂交cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppressionsubtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度靶mRNA 的灵敏度。Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的克隆。2 非特异多重引导滚环式扩增法乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步分析。自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关核酸。Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有·318 · 中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基因片段。基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准确的发现鉴别未知病毒。参 考 文 献〔1〕 Drosten C , Gunther S , Preiser W, et al1 Identification of novel corona2virus in patients with severe acute respiratory syndrome1 N Engl J Med ,2003 , 348 : 1967 - 19761〔2〕 ven den Hoogen BG, de Jong JC , Groen J , et al , A newly discoveredhuman pneumovirus isolated from young children with respiratory tractdisease1 Nat Med , 2001 , 7 : 719 - 7241〔3〕 Fouchier RA , Hartwig NG, Bestebroer TM, et al1 A previously unde2scribed coronavirus associated with respiratory disease in human1 ProcNatl Acad Sci U S A , 2004 , 101 : 6212 - 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