水中大肠杆菌检测实验论文题目

出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法Method for examination of coliform，fecal coliform and escherichia coli in food for exportSN 0169—92代替ZB X09 002—861 主题内容与适用范围本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。本标准适用于出口食品的检验。2 设备和材料 吸管：1mL，具刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。2 2 水浴箱：±℃。 培养箱：36±1℃，±℃。 冰箱：0～5℃和-15～-20℃。 均质器。乳钵和研棒。 平皿：直径90mm。天平：感量。 显微镜。 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。 玻璃珠：直径约5mm。菌落计数器。3 培养基及试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白 (LST)肉汤。 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。 EC肉汤。 伊红美蓝琼脂(EMB)。营养琼脂斜面。 色氨酸肉汤。 MR-VP培养基。 Korser氏枸椽酸盐肉汤。 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。 生理盐水。 革兰氏染色液。 Kovacs氏靛基质试剂。 甲基红指示剂。 Voges—pros kauer(V—P)试剂。4 样品制备 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2—5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。 不同食品样品匀液的制备 液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1：10的样品匀液。 固体和半固体食品以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r／min均质1～2min，制成1：10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10-2、10-3、10-4.………。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min。5 大肠菌群的测定 大肠菌群MPN值的测定 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白 (LST)肉汤，每管接种1mL。 将接种管置于36±1℃培养48±2h。 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。 大肠菌群的证实试验 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。 结果报告：按BGLB肉汤产气管数，查MPN表(见附录B(补充件))报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。6 粪大肠菌群测定 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖±℃水浴箱内，培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为℃产气阳性的大肠杆菌和℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。 结果报告：按产气管数，查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。7 大肠杆菌测定 将条中的EC肉汤管继续培养24h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板，36±1℃培养24±2h。 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±1℃培养18～24h。 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后，加Kovacs氏试剂～，上层出现红色为靛基质阳性反应。 MR—VP培养基；在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1mL至13mm×l00mm试管中，加5％ɑ—萘酚乙醇溶液，40％氢氧化钾溶液和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。将MR—VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。 LST肉汤：于30±1℃培养48±2h，观察试管中是否产气。 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：靛基质 MR VP 枸椽酸盐 鉴定（型别）+ + - - 典型大肠杆菌- + - - 非典型大肠杆菌+ + - + 典型中间型- + - + 非典型中间型- - + + 典型产气肠杆菌+ - + + 非典型产气肠杆菌如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为++--或-+--，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。8 大肠菌群固体培养基测定法 样品制备同第4章。 计数 选取适宜的三个连续稀释度的样品液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿1mL。另取lmL稀释剂加入一个灭菌平皿中，作空白对照。 将冷至45±℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10～15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀。 待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。 翻转平板，置于36±l℃培养18～24h。 选用有30～150个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为或更大。 证实 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24h和48h，观察产气情况。 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管，应进行革兰氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。 结果报告经最后证实为阳性(产气，革兰氏阴性杆菌)的试管百分比乘以于条中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液lmL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6／10×104／g(mL)＝×105／g(mL)附 录 A培养基和试剂(补充件)A1 月桂基硫酸盐胰蛋白 （LST）肉汤 胰蛋白 或胰酪胨(Trypticase)20g氯化钠 乳糖 磷酸氢二钾(K2HPO4) 磷酸二氢钾(KH2P04) 月桂基硫酸钠 蒸馏水 将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终±。A2 煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤蛋白胨 乳糖 牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 ％煌绿水溶液 蒸馏水 将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL(将脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，～)，用蒸馏水稀释到975mL，调。再加入％煌绿水溶液，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到20mm×l50mm试管(管内有倒立的小发酵管)中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终±。A3 EC肉汤胰蛋白 或胰酪 号胆盐或混合胆盐 乳糖 磷酸氢二钾(KH2P04) 磷酸二氢钾(KH2P04) 氯化钠 蒸馏水 将以上成分溶解于蒸馏水中，分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)，每管8mL。121℃高压灭菌15min，最终±0。1。A4 伊红美蓝琼脂(EMB)蛋白胨 乳糖 磷酸氢二钾(KH2P04) 琼脂 伊红γ(水溶性) 或2％水溶液20mL美蓝或％水溶液 13mL蒸馏水 在1 000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂，加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶100mL或200mL，高压灭菌15min。最终±。使用前将琼脂融化，于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊红γ水溶液和％的美蓝水溶液，摇匀，冷至45～50℃倾注平皿。A5 营养琼脂斜面牛肉膏 蛋白胨 琼脂 蒸馏水 将各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解。分装合适的试管。121℃高压灭菌15min。最终±。灭菌后摆成斜面备用。A6 色氨酸肉汤胰胨或胰酪胨 蒸馏水 加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管，每管5mL。121℃高压灭菌15min。最终±。A7 MR-VP培养基胨葡萄糖 磷酸氢二钾(K2HPO4) 蒸馏水 将各成分溶于蒸馏水中，分装试管，121℃高压灭菌15min，最终±。A8 Koser氏枸椽酸盐肉汤磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4�6�14H2O) 磷酸氢二钾(K2HPO4) 硫酸镁(MgSO4�6�17H2O) 枸椽酸钠(含2H2O) 蒸馏水 将各成分溶解于蒸馏水中，分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌15min。最终±。A9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)蛋白胨 酵母膏 乳糖 氯化钠 胆盐或3号胆盐 中性 结晶紫 琼脂 15～18g蒸馏水 将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调至±。煮沸2min，将培养基冷 45～50℃倾注平板。临用时制备，不得超过3h。A1O Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液贮存液 磷酸二氢钾(K2HPO4) 蒸馏水 500mL将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中，用lmol／L氢氧化钠约175mL调至。用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。稀释液取贮存液，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于合适容器后，121℃高压灭菌15min。A11 生理盐水氯化钠 蒸馏水 将氯化钠溶于蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。A12 革兰氏染色液结晶紫染色液： 结晶紫 ％乙醇 ％草酸铵水溶液 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。革兰氏碘液： 碘 碘化钾 蒸馏水 将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。沙黄复染液： 沙黄 ％乙醇 蒸馏水 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。染色法a. 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。b. 滴加革兰氏碘液，作用lmin，水洗。c. 滴加95％乙醇脱色约15～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。d 滴加复染液，复染lmin，水洗、待干、镜检。结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。A13 Kovacs氏靛基质试剂对二甲氨基苯甲醛 戊醇 盐酸(浓) 将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入浓盐酸即可。A14 甲基红指示剂甲基红 ％乙醇 300mL将甲基红溶解于300mL乙醇中，加水稀释至500mL。A15 Voges—Proskauer(V—P)试剂甲液 a-萘酚 无水乙醇 乙液 氢氧化钾 用蒸馏水加 附 录 B1g检样中最近似值(MPN)表(补充件)使用三管法，接种量分别为，和。阳性管数 MPN 阳性管数 0 0 0 <3 2 0 0 0 1 3 2 0 1 140 0 2 6 2 0 2 200 0 3 9 2 0 3 260 1 0 3 2 1 0 150 1 1 2 1 1 200 1 2 2 1 2 270 1 3 12 2 1 3 340 2 0 2 2 0 210 2 1 2 2 1 280 2 2 12 2 2 2 350 2 3 16 2 2 3 420 3 0 2 3 0 290 3 1 13 2 3 1 360 3 2 16 2 3 2 440 3 3 19 2 3 3 531 0 0 3 0 0 231 0 1 3 0 1 391 0 2 11 3 0 2 641 0 3 15 3 0 3 951 1 0 3 1 0 431 1 1 11 3 1 1 751 1 2 15 3 1 2 1201 1 3 19 3 1 3 1601 2 0 11 3 2 0 931 2 1 15 3 2 1 1501 2 2 20 3 2 2 2101 2 3 24 3 2 3 2901 3 0 16 3 3 0 2401 3 1 20 3 3 1 4601 3 2 24 3 3 2 11001 3 3 29 3 3 3 >1100注：①本表采用3个稀释度[(mL)、(mL)和(mL)]，每个稀释度接种3管。②表内所列检样量如改用1g(mL)、(mL)和(mL)时，表内数字应相应降低10倍：如改用(mL)、(mL)和(mL)时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推。

网上很多题目，都不是原创，最好别用。之前也是网上down的一篇，老师直接说不行。还是后来学长给的雅文网，写的《大肠杆菌检验方法的探究与分析》，十分专业。看下参考文献吧 [1] 毕玲玲1,孙成春2,公衍文3,张欣悦1,安小通1. 黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌临床分布和耐药表型分析[J]. 军医进修学院学报. [2] 熊燕,张虹,陈炎添,容永璋. 社区和医院获得性血流感染的病原菌分布及感染途径调查[J]. 检验医学. 2014(10) [3] 于霞,尚媛媛,赵立平,董玲玲,马异峰,王晓波,黄海荣. 分子杂交法快速鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的初步评价[J]. 检验医学. 2014(10) [4] 张景皓,王家路,赵虎. 新疆汉族与维吾尔族HBV耐药变异类型与基因型研究[J]. 检验医学. 2014(10) [5] 张津萍,尤永燕,沙仲,张瑞丽,王千秋. FQ-PCR与血清型特异性抗体法检测HSV-2的临床意义[J]. 检验医学. 2014(10) [6] 赵付菊,赵虎. 染色体介导AmpC β-内酰胺酶表达的分子调控机制的研究进展[J]. 检验医学. 2014(10) [7] 乔昀,赵英妹,仲俊,张珏,龚捷文. 实时荧光定量PCR在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的评价与应用[J]. 检验医学. 2014(07) [8] 刘锦燕,倪培华,史册,魏冰,项明洁. 白念珠菌14-α脱甲基酶K143Q氨基酸置换与氟康唑耐药形成的相关性研究[J]. 检验医学. 2014(07) [9] 张勇,刘爱胜,文艳. 75株碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌ERIC-PCR菌种分型及其主要耐药机制研究[J]. 检验医学. 2014(07) [10] 胡海燕,裘先前,许照美. 1株与福氏志贺菌Y变种交叉凝集的摩根摩根菌鉴定结果[J]. 浙江预防医学. 2014(10)

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