基因编辑的原理

基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。

基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行定点“编辑”。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，也称“分子剪刀”，在基因组中特定位置产生位点特异性双链断裂，诱导生物体通过非同源末端连接或同源重组来修复DSB，因为这个修复过程容易出错，从而导致靶向突变。这种靶向突变就是基因编辑。现在运用最多的基因编辑就是CRISPR/Cas系统，CRISPR全称是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（成簇的规律间隔的短回文重复序列），而Cas的全称是CRISPR associated（CRISPR关联）。在CRISPR/Cas系统中，CRISPR/Cas9系统是研究最深入，应用最成熟的一种类别。CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代基因组定点编辑技术。

我之前碰到过类似的问题，总结一下就是，基因编辑的原理的确是基因突变，不是基因重组。基因编辑是比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰（改变几个碱基之类的）；转基因技术才是基因重组（将特定的外源目的基因转移到受体生物中）。

2019年10月21日，哈佛大学Broad研究所刘如谦（David R. Liu）教授团队在Nature上发表“Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA”的研究论文，开发了一种全新的精准基因编辑工具——prime editing。 Prime editing不会产生DNA双链断裂，不需要供体DNA。 Prime editing需要设计一种特殊的gRNA，也就是pegRNA。与普通的gRNA不同，这种pegRNA不但能够结合想要进行编辑的特定DNA区域，还自带“修改模板”。Cas9-逆转录酶融合蛋白会在pegRNA的引导下，精准地切开一条DNA链，然后根据“修改模板”，合成含有正确序列的DNA。细胞内的DNA修复机制会自动把这段新合成的序列整合进基因组。 Prime editing系统由两部分构成： 其一 是nCas9 (H840A)与工程化改造的逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）融合构成的效应蛋白； 其二 是pegRNA（Prime Editing Guide RNA），包括了single-guide RNA（sgRNA）、引物结合位点（Prime Binding Site，PBS）和储存有靶向位点编辑信息的反转录模板（RT templet with edit）。 基本工作原理为： 首先是在pegRNA的引导下，nCas9 (H840A)切口酶切断含PAM的靶点DNA链，断裂的靶DNA链与pegRNA的3'末端PBS序列互补并结合，之后逆转录酶发挥功能，沿RT模板序列开始逆转录反应。反应结束后DNA链的切口处会形成处在动态平衡中的5'-和3'-flap结构，其中3'-flap的DNA链携带有目标突变，而5'-flap结构的DNA链则无任何突变。细胞内5'-flap结构易被结构特异性内切酶识别并切除，之后经DNA连接和修复后靶位点处便实现了精准的基因编辑。（流程图如下）