chip发表研究论文

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcriptionfactor,TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。染色质免疫沉淀分析（ChiP）是基于体内分析发展起来的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，CHIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。第一天：（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％（培养基共有9ml）。2、37摄氏度孵育10min。3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为。450 ul 甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。7、超声破碎：VCX750，25％功率，冲击，9S间隙。共14次。（二）、除杂及抗体哺育。8、超声破碎结束后，10，000g 4oC离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于-80oC。300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl终浓度为），65oC处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50×PIC。再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转混匀1h。10、1h后，在4oC静置10min沉淀，700rpm离心1min。11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体，另一管中则不加抗体。4oC颠转过夜。（三）、检验超声破碎的效果。取100ul超声破碎后产物，加入4ul5MNaCl，65oC处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。第二天：（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。12、孵育过夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4oC颠转2h。13、4oC静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4oC颠转10min，4oC静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。洗涤溶液： salt wash buffer-one wash buffer-one wash buffer-one buffer-two wash15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul10％SDS，100ul1MNaHCO3，800ulddH2O，共1ml。每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为）。混匀，65oC解交联过夜。第三天：（一）、DNA样品的回收17、解交联结束后，每管加入1ulRNaseA（MBI），37oC孵育1h。18、每管加入，（），2ul10mg/ml蛋白酶K。45oC处理2h。19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。（二）、PCR分析

染色质免疫共沉淀技术是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来的技术。

这项技术主要用来分析目标基因有没有活性、或者分析一种已知蛋白（转录因子）的靶基因有哪些。该技术主要应用于以下几方面：

1.组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”

2.转录调控分析

3.药物开发研究

4.有丝分裂研究

损失与凋亡分析

扩展资料：

实验步骤：

1、细胞固定

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。

值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

2、染色质断裂

交联后的染色质可被超声波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段（用琼脂糖凝胶电泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。

所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。

技术应用：

1、Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理的结果更精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和DNA-蛋白复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时，经常采用没经过甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。

因为N-ChIP没经过甲醛固定，超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合，所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品，一般选择超声波处理方法。也有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。

2、染色质免疫沉淀的DNA适用于多种分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要验证的，可采用狭缝杂交（Slot blot）的方法，把靶序列特异性探针与染色质免疫沉淀的DNA杂交，来验证目的蛋白与DNA靶序列的特异性结合。

还可以根据靶序列设计引物，用半定量PCR的方法进行测定，或采用Real-time PCR方法进行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的（high-throughput），可采用Southern杂交。但因为免疫沉淀的DNA量较少，所以在研究时通常要用PCR方法扩增DNA探针，再进行整个基因组扫描。

还可以把沉淀的DNA克隆到载体中，进行测序，寻找该序列附近的开放阅读框，发现新的基因调节序列。

3、目前，随着人类基因组测序工作的基本完成，研究目的蛋白和整个基因组的相互作用逐渐成为研究的热点。由于基因组中的信息量非常大，上述常规方法通常无法满足科研的需要。近年来发展起来的ChIP-chip技术将基因组DNA芯片（chip）技术与染色质免疫沉淀技术（ChIP）相结合，为研究目的蛋白与整个基因组相互作用提供了可能。

ChIP-chip 技术通过标记染色质免疫沉淀富集的DNA片段，和另一个被标记不同探针的对照组样品一起，与DNA芯片杂交，再利用各种生物信息学方法对收集到的信号进行分析，具体的实验步骤请参考Dr. Richard Young在Nature Protocols上的文章。

ChIP-chip技术已经被广泛应用于研究转录因子在整个基因组中的信号网络，染色质修饰机制在基因组中的调控，DNA的复制，修复以及修饰，基因的转录与核运输等诸多方面。

4、染色质免疫沉淀技术还可用于分析两种蛋白共同结合的DNA序列，即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联，而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀，从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。

值得注意的是，因为通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少，所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作。

5、随着染色质免疫沉淀技术受到广泛的关注，运用该技术发表的文章也逐渐增多，大家越来越多的开始关注如何改进ChIP的方法。Millipore最新推出的Magna ChIP试剂盒，利用磁珠分离DNA-蛋白-抗体复合物，提高了ChIP的效率，简化了操作的过程，缩短了实验的时间，还为同时进行多个目的蛋白的研究提供了可能，是经常使用ChIP技术的研究人员的理想选择。

6、近年来ChIP技术也被用于研究RNA-蛋白的相互作用，其原理与DNA类似，也包括甲醛固定，超声波破细胞，免疫沉淀，交联逆转，RNA纯化和RNA鉴定等步骤。所不同的是，交联逆转只用Proteinase K，要进行RNA纯化和不含RNase的DNase处理，分析时用RT-PCR，芯片杂交要用cDNA芯片等。

参考资料：百度百科-染色质免疫共沉淀

与传统的EMSA技术相比，基于体内分析而发展的染色质免疫沉淀分析（Chromatin immunoprecipitation assay kit,ChIP）技术能更加真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。ChIP技术和芯片技术的结合有利于确定全基因组范围内染色体蛋白的分布模式以及组蛋白修饰情况。该技术主要应用于：1.组蛋白修饰研究 2.转录调控分析 3.药物开发研究 4.有丝分裂研究 损伤与凋亡分析。 Upstate公司最先开发出步骤优化简捷的商业化ChIP分析试剂盒，保证实验的准确性和可重复性，同时Upstate提供广泛可行的ChIP级别应用抗体。ChIP基本试剂盒和特定蛋白质ChIP级别应用抗体结合完成一个完整的染色质免疫沉淀分析。 ChIP技术的作用原理： 甲醛处理使蛋白质与DNA交联； ChIP基本试剂盒组分：ssDNA/Protein A agarose ssDNA/Protein G AgaroseChIP Dilution BufferLow salt wash bufferHigh salt wash bufferLiCl Wash BufferTE EDTA5M NaCL1M Tris-HCl, pH Lysis Buffer（以上各组份也可分别购买） 超声波将染色质打断成一定大小； 通过抗体沉淀蛋白质-DNA交联复合体； 解除交联，纯化DNA； PCR确定和DNA结合的蛋白量；