英国医学杂志的合体实验

克隆是英语单词clone的音译，clone源于希腊文klone，原意是指幼苗或嫩枝，以无性繁殖或营养繁殖的方式培育植物，如杆插和嫁接。如今，克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群。克隆也可以理解为复制、拷贝，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同。1997年2月，绵羊“多利”诞生的消息披露，立即引起全世界的关注，这头由英国生物学家通过克隆技术培育的克隆绵羊，意味着人类可以利用动物身上的一个体细胞，产生出与这个动物完全相同的生命体，打破了千古不变的自然规律。什么东西可以克隆？应该说有生命的都可以克隆。现在已经克隆什么？蛙:1962年，未成功。鲤鱼:1963年，中国科学家童第周早在1963年就通过将一只雄性鲤鱼的遗传物质注入雌性鲤鱼的卵中从而成功克隆了一只雌性鲤鱼，比多利羊的克隆早了33年。但由于相关论文是发表在一本中文科学期刊，并没有翻译成英文，所以并不为国际上所知晓。（源自：PBS）古代神话里孙悟空用自己的汗毛变成无数个小孙悟空的离奇故事，表达了人类对复制自身的幻想。1938 年，德国科学家首次提出了哺乳动物克隆的思想，1996年，体细胞克隆羊“多利”出世后，克隆迅速成为世人关注的焦点，人们不禁疑问：我们会不会跟在羊的后面？这种疑问让所有人惶惑不安。然而，反对克隆的喧嚣声没有抵过科学家的执着追求，伴随着牛、鼠、猪乃至猴这种与人类生物特征最为相近的灵长类动物陆续被克隆成功，人们已经相信，总有一天，科学家会用人类的一个细胞复制出与提供细胞者一模一样的人来，克隆人已经不是科幻小说里的梦想，而是呼之欲出的现实。目前，已有三个国外组织正式宣布他们将进行克隆人的实验，美国肯塔基大学的扎沃斯教授正在与一位名叫安提诺利的意大利专家合作，计划在两年内克隆出一个人来。由于克隆人可能带来复杂的后果，一些生物技术发达的国家，现在大都对此采取明令禁止或者严加限制的态度。克林顿说：“通过这种技术来复制人类，是危险的，应该被杜绝！”全国政协委员、中国科学院国家基因研究中心主任洪国藩也明确表示反对进行克隆人的研究，而主张把克隆技术和克隆人区别开来。克隆人，真的如潘多拉盒子里的魔鬼一样可怕吗？实际上，人们不能接受克隆人实验的最主要原因，在于传统伦理道德观念的阻碍。千百年来，人类一直遵循着有性繁殖方式，而克隆人却是实验室里的产物，是在人为操纵下制造出来的生命。尤其在西方，“抛弃了上帝，拆离了亚当与夏娃”的克隆，更是遭到了许多宗教组织的反对。而且，克隆人与被克隆人之间的关系也有悖于传统的由血缘确定亲缘的伦理方式。所有这些，都使得克隆人无法在人类传统伦理道德里找到合适的安身之地。但是，正如中科院院士何祚庥所言：“克隆人出现的伦理问题应该正视，但没有理由因此而反对科技的进步”。人类社会自身的发展告诉我们，科技带动人们的观念更新是历史的进步，而以陈旧的观念来束缚科技发展，则是僵化。历史上输血技术、器官移植等，都曾经带来极大的伦理争论，而当首位试管婴儿于1978年出生时，更是掀起了轩然大波，但现在，人们已经能够正确地对待这一切了。这表明，在科技发展面前不断更新的思想观念并没有给人类带来灾难，相反地，它造福了人类。就克隆技术而言，“治疗性克隆”将会在生产移植器官和攻克疾病等方面获得突破，给生物技术和医学技术带来革命性的变化。比如，当你的女儿需要骨髓移植而没有人能为她提供；当你不幸失去5岁的孩子而无法摆脱痛苦；当你想养育自己的孩子又无法生育……也许你就能够体会到克隆的巨大科学价值和现实意义。治疗性克隆的研究和完整克隆人的实验之间是相辅相成、互为促进的，治疗性克隆所指向的终点就是完整克隆人的出现，如果加以正确的利用，它们都可以而且应该为人类社会带来福音。科学从来都是一把双刃剑。但是，某项科技进步是否真正有益于人类，关键在于人类如何对待和应用它，而不能因为暂时不合情理就因噎废食。克隆技术确实可能和原子能技术一样，既能造福人类，也可祸害无穷。但“技术恐惧”的实质，是对错误运用技术的恐惧，而不是对技术本身的恐惧。目前，世界各国对克隆人的态度多有“暧昧”，英国去年以超过三分之二的多数票通过了允许克隆人类早期胚胎的法案，而在美国、德国、澳大利亚，也逐渐听到了要求放松对治疗性克隆限制的声音。可以说，哪一个国家首先掌握了克隆人的技术，就意味着这个国家拥有了优势和主动，而起步晚的国家可能因此而遭受现在还无法预测的损失。如同当年美国首先掌握了原子能技术，虽然这项技术从一开始便展现着它罪恶的一面，但后来各国又不得不加紧这方面的研究和实验。单从这个角度上讲，对克隆人实验采取简单否定的态度也是值得探讨的。至于人们担忧克隆技术一旦成熟，会有用心不良者克隆出千百个“希特勒”，或者克隆出另一个名人来混淆视听，则是对克隆的误解。克隆人被复制的只是遗传特征，而受后天环境里诸多因素影响的思维、性格等社会属性不可能完全一样，即克隆技术无论怎样发展，也只能克隆人的肉体，而不能克隆人的灵魂，而且，克隆人与被克隆人之间有着年龄上的差距。因此，所谓克隆人并不是人的完全复制，历史人物不会复生，现实人物也不必担心多出一个“自我”来。绵羊:1996年，多利（Dolly）猕猴:2000年1月，Tetra，雌性猪:2000年3月，5只苏格兰PPL小猪；8月，Xena，雌性牛:2001年，Alpha和Beta，雄性猫:2001年底，CopyCat（CC），雌性鼠:2002年兔:2003年3-4月分别在法国和朝鲜独立地实现；骡:2003年5月，爱达荷Gem，雄性；6月，犹他先锋，雄性鹿:2003年，Dewey马:2003年，Prometea，雌性狗:2005年，韩国首尔大学实验队，史纳比尽管克隆研究取得了很大进展，目前克隆的成功率还是相当低的：多利出生之前研究人员经历了276次失败的尝试；70只小牛的出生则是在9000次尝试后才获得成功，并且其中的三分之一在幼年时就死了；Prometea也是花费了328次尝试才成功出生。而对于某些物种，例如猫和猩猩，目前还没有成功克隆的报道。而狗的克隆实验，也是经过数百次反覆试验再得来的成果。多利出生后的年龄检测表明其出生的时候就上了年纪。她6岁的时候就得了一般老年时才得的关节炎。这样的衰老被认为是端粒的磨损造成的。端粒是染色体位于末端的。随着细胞分裂，端粒在复制过程中不断磨损，这通常认为是衰老的一个原因。然而，研究人员在克隆成功牛后却发现它们实际上更年轻。分析它们的端粒表明它们不仅是回到了出生的长度，而且比一般出生时候的端粒更长。这意味着它们可以比一般的牛有更长的寿命，但是由于过度生长，它们中的很多都过早夭折了。研究人员相信相关的研究最终可以用来改变人类的寿命。 克隆人违背人类生命伦理 现代科技，特别是现代生命科技，要不要尊重伦理学原则，要不要倾听伦理的声音？有关专家针对一些科学狂人在美国秘密克隆人的做法指出——克隆人违背人类生命伦理，存在着极大的争议和难以解决的一系列法律等问题。 我国多家媒体近日转载了国外媒体报道的一条惊人消息：一群受邪教组织操纵的科学狂人，正在美国内华达州大漠深处进行着一项克隆人的秘密实验。他们根据英国科学家创造世界第一只克隆羊“多利”的同样原理，从一个今年2月份夭折的10个月大的美国女婴身上提取细胞制造克隆人。据称，“如果进展顺利的话，世界上第一个克隆人将于明年年底诞生。” 消息披露后，克隆技术及其带来的伦理学问题再一次成为人们议论的热点。如果这一消息属实的话，应当如何看待此事，如何正确地评价和思考这个问题，记者为此走访了国家人类基因组南方研究中心伦理、法律和社会部主任、上海社科院哲学研究所沈铭贤研究员。 沈教授说：自1997年英国罗斯林研究所成功地克隆出“多利”羊后，国外不断有人在名利的驱使下，提出并试图从事克隆人的研究。尽管各国政府明令禁止，但与克隆人有关的报道近两年来不止一次见诸报端。但是，这次速度这么快，又与邪教组织有关联，确实令人感到震惊。 痛失爱女的父母，希望通过克隆技术使女儿复活，这种心情是可以理解的。但如果科学家借此进行克隆人的实验，就值得讨论了。沈教授认为：即使撇开邪教不谈，这种做法也是不可取的。就“克隆人”这一个体而言，他会生活在“我是一个死去的人的复制品” 这样一个阴影中，这对他的心理会产生什么样的影响？ 按照生命伦理学的观点，科学技术要从长远利益出发，造福整个人类。它必须遵循“行善、不伤害、自主和公正”这四项国际公认的伦理原则。“多利”羊的克隆成功经过了200多次的失败，出现过畸形或夭折的羊。而克隆人更为复杂，无疑会遇到更多的失败，如果制造出不健康、畸形或短寿的人，将是对人权的一种侵犯。 人类基因的多样性是人类进化的生物学基础，而那些科学狂人要制造的所谓“不朽的生命”，实际上是同一基因的翻版，这就有可能减少基因的多样性，不利于人类本身的进化。所以，无论从个体、整体，还是从社会进化、生命伦理角度看，都应该坚决反对克隆人的行为。 沈教授指出：现在科学界把克隆分为治疗性克隆和生殖性克隆两种。前者是利用胚胎干细胞克隆人体器官，供医学研究、解决器官移植供体不足问题，这是国际科学界和伦理学界都支持的，但有一个前提，就是用于治疗性克隆的胚胎不能超出妊娠14天这一界限。而对于生殖性克隆，即通常所说的克隆人，由于它在总体上违背了生命伦理原则，所以，科学家的主流意见是坚决反对的。联合国教科文组织、世界卫生组织和国际人类基因组伦理委员会和各国政府也都非常明确地表示，反对生殖性克隆。即使克隆人真的诞生了，我们还是要坚持这一基本立场。 现代科学技术是一把双刃剑，在其造福人类的同时也会带来一些负面效应。这就向我们提出了一个问题：现代科技，特别是现代生命科技，要不要尊重伦理学原则，要不要倾听伦理的声音？沈教授指出：现在有些科学家提出，只要科学上有可能做到的，就应该去做。事实上，这是错误的观点。如果技术上我们能制造出一种严重危害人类的超级生命，难道也可以去制造吗？一些科学狂人正是打着“科学自由”的旗号，去做一些危害人类的事。因此，我们要警惕现代科学技术被一些别有用心的人利用。另外，也不能把科学自由和伦理道德对立起来。现代生命科学发展的事实表明，伦理的规范和引导，并没有束缚科学的发展，倾听伦理的声音，有利于科学更健康、顺利地发展。

高变异DNA 序列的发现1980 年，Wyman 和 White 在进行人体DNA 基因文库的研究中，筛选到一个随机DNA 片段，以其为探针进行RFLPs 分析，检测到8 个等位基因，平均杂合率超过75%，因此推测该位点的多态性来源于DNA 重排而非碱基突变，这是人类基因组中发现的第一个高变区（hypervariable regions，简称HVRs）。此后，人们在人类基因组中又陆续发现了其他一些高变区，如α-珠蛋白基因（Higgs 等 1981，1986）、胰岛素基因（Bell 等 1982）、脂蛋白基因（Knott等 1986）、D-Ha-ras 癌基因（Capon 等 1983）、Zata-珠蛋白基因（Goodbourm 等 1983）等基因的侧翼及肌红蛋白基因（Weller 等1984）的第一个内含子区域，都含有这种HVRs。这些高变区的共同特点为：都是由一短序列（即重复单位）首尾相连、多次重复而成，其多态性来源于重复单位的重复次数不同。同一高变区的这些重复单位还具有高度的保守性，但因重复单位的重复数目不同，形成了众多的等位基因。这些高变区后来被叫做小卫星（minisatellite）（Jeffreys 等 1985a），有的人又称其为可变数目串联重复序列（variable number of tandemrepeat，简称VNTR）（Nakmura 等1987）。在小卫星DNA 内，重复单位数目的高度变异是由于不等交换所造成的，换言之，即在有丝分裂时的姊妹染色单体（sister chromatids）或减数分裂时的同源染色体间互换所致。有时候，发现DNA 链架突变的发生频率高于点突变，其频率为每世代每千个核苷酸对在10－ 5～10－ 2。虽然不等互换导致重复单位数目增加或减少，但不同重复的形成却是由于点突变造成的。此外，基因转换（gene conversion）与重组似乎在同源性的维持上扮演着重要的角色。在DNA 复制期间的滑动复制（slippage）是重复单位内简单序列 （1～4 个核苷酸对）演化的机制（Wolf 等 1989）。故有丝分裂或减数分裂时不等互换、基因转换及滑动复制，均足以导致重复单位间同源性的维持及重复单位数目的变化。大多数重复序列单位共有一个约 10～15 个核苷酸对的核心序列（core sequence），此核心序列高度地保留于相关的小卫星DNA 家族中，它是重组信号，可能是真核生物DNA 重组交换的热点，可促进小卫星DNA 的不等交换（Jeffreys 等 1985a；Wyman 等 1990）。核心序列是重复单位间序列相似的基础。在小卫星DNA 区域内，同源染色体可能有不同数目的重复单位，利用限制性内切酶可产生DNA 指纹。由此可见，串联重复序列的高度变异性与其特殊的结构密切相关。然而，基因组中此类串联重复序列的真实生物学功能至今仍不清楚。 DNA 指纹图谱的发现1985 年，英国来斯特大学遗传系的Jeffreys（1985a）及其同事在《Nature》杂志上报道了他们对人体基因组高变区的突破性研究。他们用肌红蛋白基因第一个内含子中的串联重复序列（重复单位长33bp）作探针，从人的基因文库中筛选出8 个含有串联重复序列（小卫星）的重组克隆。经序列分析，发现每个克隆都含有一个长～、由重复单位重复3～29 次组成的小卫星DNA。尽管这8 个小卫星的重复单位的长度（16～64bp）和序列不完全相同，但都含有一段相同的核心序列，其碱基顺序为 GGGCAGGAA。他们用 16bp 重复单位（主要为核心序列）重复29 次而成的小卫星做探针，与人基因组酶切片段进行Southern 杂交，在低严谨条件下杂交产生由10 多条带组成的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位置是千差万别的。随后他们用另外一个小卫星探针 进行测试，获得了类似的图谱。这种杂交图谱就像人的指纹一样因人而异，因而Jeffreys（1985b）等人称之为DNA 指纹图谱（DNA finger print），又名遗传指纹图谱（genetic finger print）。产生DNA 指纹图谱的过程就叫做DNA 指纹分析（DNA finger printing）。 DNA 指纹图谱的特点DNA 指纹图谱具有以下3 个基本特点：（1）多位点性：基因组中存在着上千个小卫星位点，某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。一般来说，一个DNA 指纹探针（又称多位点探针）产生的某个个体DNA 指纹图谱由10～20 多条肉眼可分辨的图带组成。由于大部分杂合小卫星位点，仅一个等位基因出现在图谱的可分辨区内（两个等位基因由于重复单位、重复次数不同，在长度上差异很大），因而每条可分辨图带代表一个位点。很多的研究表明，个体DNA 指纹图谱中的带很少成对连锁遗传，所代表的位点广泛地分布于整个基因组中（Burke 等1987；Hiu 等1985）。一个传统的RFLPs 探针一次只能检测一个特异性位点的变异性，所产生的图谱一般由l～2 条带组成，仅代表一个位点。因此两者比较而言，DNA指纹图谱更能全面地反映基因组的变异性。（2）高变异性：DNA 指纹图谱的变异性由两个因素所决定，一是可分辨的图带数，二是每条带在群体中出现的频率。DNA 指纹图谱反映的是基因组中高变区，由多个位点上的等位基因所组成的图谱必然具有很高的变异性。DNA 指纹图谱在个体或群体之间表现出高度的变异性，即不同的个体或群体有不同的DNA 指纹图谱。一般选用任何一种识别4 个碱基的限制性内切酶，这种变异性就能表现出来。Jeffreys 等 （1985b）对人的DNA 指纹图谱的研究表明，DNA 指纹图谱中的大部分谱带都以杂合状态存在，平均杂合率大于70%，某些大片段的杂合率甚至高达100%。用探针 进行DNA 指纹分析时，发现两个无血缘关系的个体具有相同DNA 指纹图谱的概率仅为3× 10－11；而将探针 和 产生的DNA 指纹图谱综合起来分析时，则这种概率为5×10－19，可见DNA 指纹图谱具有高度的个体特异性。但是，同卵双胞胎的DNA 指纹图谱是相同的，因其有完全相同的基因组（Hiu 等1985）。值得注意的是，由于琼脂糖凝胶电泳分辨率的限制，DNA 指纹图谱大片段区域的变异性往往很高，而小片段区域的变异性则很低，因此在实际操作时往往将小于 2kb 的小片段跑出胶外或不作统计。（3）简单而稳定的遗传性：Jeffreys 等（1985a）通过家系分析表明，DNA 指纹图谱中的谱带能够稳定地从上一代遗传给下一代。子代DNA 指纹图谱中的每一条带都能在其双亲之一的图带中找到，而产生新带的概率（由基因突变产生）仅在～ 之间。DNA 指纹图谱中的杂合带遵守盂德尔遗传规律，双亲的各图带平均传递给50%的子代。DNA 指纹图谱还具有体细胞稳定性，即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等的DNA 做出的DNA 指纹图谱是一致的（Gill 等1985），但组织细胞的病变或组织特异性碱基甲基化可导致个别图带的不同。 DNA 指纹图谱的应用由于DNA 指纹图谱具有多位点性、高变异性、简单而稳定的遗传性，因而自其诞生就引起了人们的重视，表现出巨大的实用价值。DNA 指纹图谱的高变异性和体细胞稳定性可用于鉴定个体，这对法医学上鉴别犯罪分子和确定个体间的血缘关系极有价值（Jeffreys 等1985b，1985c）。如我国公安部利用DNA 指纹图谱已侦破数百例疑难案件。其简单的遗传性可用来鉴定亲子关系，其多位点性可用来检测目标基因组的病变及治疗等过程中的改变情况。1987 年Burke、Jeffreys 和Wetton 等报道了用人源核心序列小卫星探针 和 检测到哺乳动物到鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫等的高变异小卫星，产生具有个体特异性或类群特异性的DNA 指纹图谱。1988 年，Dallas 用人源小卫星探针 获得了水稻的DNA 指纹图谱。随后，美国华盛顿大学生物系Nybom 等人对果树植物的DNA 指纹图谱进行了大量的研究。1989年，Braithwaite 和Manners 首次将人源小卫星探针 和 用作真菌的DNA 指纹分析获得了成功，从而进一步证明DNA 指纹技术具有广泛的适用性。这些发现使DNA 指纹图谱成为研究动植物群体遗传结构、生态与进化、分类等很有价值的遗传标记。 DNA 指纹图谱的研究进展 DNA 指纹分析的探针两个最早的DNA 指纹探针是1985 年Jeffreys 及其同事所发现的人源小卫星探针 和（Jeffreys 等 1985a）。1987 年，Vassart 等发现无外源DNA 片段的细菌噬菌体M13 本身就能够作为一个DNA 指纹探针检测出人和动物基因组中的高变异小卫星DNA，其有效序列是蛋白质 Ⅲ 编码区内的两个小卫星序列。从此，M13 便也成为各种动植物重要的DNA 指纹探针（Gatei 等 1991；Kuhnlein 等 1989）。另一个在人和动物上广泛应用的 DNA 指纹探针是3´HVR（Jarman 等 1986），它来源于人α-珠蛋白的3´端的一个高度重复区。以上4 个小卫星探针的重复单位的序列结构如下所示：（AGGGCTGGAGG）（AGAGGTGGGCAGGTGG）M13（GAGGGTGGNGGNTCT）3´HVR（GNGGGGNACAG）从迄今已有的报道来看，在DNA 指纹分析中用得最多的多位点小卫星探针为、、M13 及3´HVR。此外，人们还从某些动物的基因组中分离克隆了一些小卫星DNA 用作DNA 指纹探针。如牛的小卫星探针PSRC-7（ Plante 等 1991）和猪的小卫星探针pS35（Coppieters 等 1990）。人工合成的简单重复序列微卫星探针也广泛地用于DNA 指纹分析，如（GTG）5 、（TG）8、（AT）8、（TCC）5 、（GACA）4。从基因组中分离克隆的微卫星DNA 指纹探针有PGB725 （牛）（Kashi 等 1990）和 （猪）（Haberfield 等 1991）。 孟安明（1993）发现，任何一个动物个体的基因组总DNA 可标记作为DNA 指纹探针（基因组探针），在该个体所属物种及其他相关物种上产生具有个体特异性的杂交图谱。以基因组探针进行DNA 指纹分析不需通过复杂的操作来获得探针DNA，有利于DNA 指纹技术的推广。 DNA 指纹图谱的重要发展DNA 指纹图谱的重要发展是微卫星DNA 指纹图谱。微卫星（microsatellite）是由2～6 个核苷酸组成的重复单位串联排列而成的DNA 序列。据估计，在真核生物基因组每10kb 的DNA 序列中至少有一个微卫星（Tautz 1989），如人体基因组中仅二核苷酸串联重复的微卫星就多达 50 000～100 000 个。大多数微卫星的长度小于 200bp，但也有更长的微卫星。微卫星不同于小卫星，它们广泛分布于很多结构基因的内含子、基因间隔区甚至调控序列中（Tautz 等 1984；Weising 1989；Ishii 等 1985）。早在1974 年，Skinner 等就在寄居蟹（hermit crab）基因组中发现了微卫星DNA，当时叫做简单串联重复序列（simple tandem repeat）。Singh 等人在1980 年发现蛇的W 性染色体上也存在着这种序列，它是由GATA/GACA 重复单位组成的。以后的研究表明，在真核生物甚至原核生物的基因组中都普遍存在这种序列（Jones 等 1981；Tautz 等 1986）。直到1986 年，Ali 等人首次用合成的GATA/GACA 寡聚核苷酸作探针用于人的DNA 指纹分析，成功地开创了利用微卫星DNA 探针进行DNA 指纹分析这一新的领域。微卫星探针易于合成，可直接与固定在干胶中的DNA 片段杂交，所检测的位点普遍具有高度的变异性。1988 年，Schafer 等人进一步发展了这门技术，使寡聚核苷酸（微卫星）分析技术又一次得到了完善。迄今为止，合成的各种寡聚核苷酸（微卫星）已成功地应用于人和近百种动植物的DNA 指纹分析（Buitkamp 等 1991a，1991b；Schafer 等1988；May 等 1991；Nuraburg 等 1989；Hubert 等 1990；Lonn 等1992；Biermerth 等 1992；Caetano-Anolles 等 1991）。从已有的报道来看，适用范围广、变异性高的微卫星探针主要有（GTG）n、（GT）n、（GATA）n、（GACA）n、（GAG）n 等（Buitkamp 等1991a，1991b）。 PCR 在DNA 指纹分析中的应用PCR 是一种在体外大量扩增DNA 的方法。在法医研究上，由于所检验的材料量（如血斑、精斑、发梢）极微，因此很难获得常规Southern 杂交所需的DNA 量，利用PCR 就可以解决这一问题。Jeffreys 等（1988）根据多个小卫星的已知侧翼序列来合成引物（每个小卫星两个引物）。先以极微量（ 甚至单个细胞 ）的人类基因组DNA 为模板进行体外扩增（产物可长达10kb），然后再用这些小卫星的混合探针进行Southern 杂交，得到了可以重复做出的具有高度变异性的DNA 指纹图谱。 单位点高变异性小卫星和微卫星探针的开发DNA 指纹图谱虽然具有很多的优点，但并非完整无缺。第一，DNA 指纹图谱中每一个个所含图带数很多，给统计分析带来了许多麻烦。例如，在比较个体之间的DNA 指纹图谱时，如果某两条带的位置相差很小，那么就很难判断它们是否来自同一位点上的同一等位基因，也许是由于实验操作过程中凝胶变形等引起的误差影响了分析结果的准确性。第二，DNA 指纹图带的分辨率很难提高，特别是较小的DNA 片段因难以分开而呈现很低的变异性；长度相差不大的DNA 片段无法通过电泳分开。第三，DNA 指纹图谱不能区分杂合体和纯合体。在进行DNA 指纹图谱统计分析时，人们假定图中每一条带分别代表不同的位点，但实际上，如果某一位点是杂合的，那么此位点在DNA 指纹图谱上会拥有两条带，也就是说在DNA 指纹图谱上应有两条带代表同一个杂合位点上的不同等位基因。因此，有时以DNA 指纹图谱分析得到的结果与真实情况也会有所不同。第四，对于某一个位点来说，往往只有一个等位基因出现在DNA 指纹图谱上，因此无法根据DNA 指纹图谱确定个体在该位点上的基因型。为了克服DNA 指纹图谱的上述缺点，人们已开始重视单位点探针的开发。所谓单位点探针，是指只是特异性与某一位点上的等位基因杂交的探针。由于真核基因组中的小卫星和微卫星位点普遍具有高度的变异性，因此它们是高变异单位点探针的重要来源。基因组中的小卫星位点有数千个，微卫星位点更达数十万个，通过用现有的多位点小卫星和微卫星探针筛选基因文库，可以得到众多的高变异单位点探针。迄今为止，国外一些单位已从猪、马、鸡、牛等的基因组中分离、克隆了数百个小卫星和微卫星探针，这些探针将是构建有关畜禽基因图谱的基础。 其他方面的进展双向电泳（two-dimensional electrophoresis）的应用，使 DNA 指纹图谱的容量大大增加（Uitterlinden 等 1989）。变性凝胶电泳可以更有效地分辨等位基因（Uitterlinden 等1989）；电极反转电泳（field inversion gel electrophoresis）提高了 DNA 指纹图谱中大片段的分辨率（Fowler 等 1988）。由于DNA 指纹图谱在实验技术和统计方法上一直处于不断的改进之中，因此我们深信在不远的将来，DNA 指纹分析技术必将在医学、畜牧业、农业乃至整个生物领域得到更加广泛的应用。

早睡早起，不熬夜，健康清淡饮食，每天锻炼一小时，心情愉悦

《美国医学会杂志》简称，仅次于NEJM《新英格兰医学杂志》的世界权威医学杂志，与《柳叶刀》Lancet，《英国医学杂志》BMJ号称世界四大权威综合医学杂志。

隆是英文 clone的音译，简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。但克隆与无性繁殖是不同的。无性繁殖是指不经过雌雄两性生殖细胞的结合、只由一个生物体产生后代的生殖方式，常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、茎、叶等经过压条、扦插或嫁接等方式产生新个体也叫无性繁殖。绵羊、猴子和牛等动物没有人工操作是不能进行无性繁殖的。科学家把人工遗传操作动、植物的繁殖过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。

当四年前克隆绵羊“多莉”出生以后，一石激起千层浪，世界各国就动物基因繁殖问题展开了日益激烈的争论。 下面是我的一些理解及看法： 首先，克隆的定义是独立细胞繁殖系，指后代完全由一个细胞复制，具有完全相同的遗传物质。它是特制一种生物学操作。克隆是无性繁殖，但无性繁殖不一定就是克隆。且不说植物，就是许多低等动物，都可以在雌雄同体的情况下，进行孤雌生殖，由于有雌、雄配子的结合，染色体进行了交换，它的后代的遗传表现产生了变化。 有些人认为克隆能用来挽救濒危动物，我认为不能。因为挽救濒危动物需要提高他们的繁殖能力。而克隆做的是另外一件事情：得到遗传结构完全相同的后代；而且克隆技术无论如何都是一个降低繁殖能力的办法。我们应当尽快保存那些濒危动物尽量多个体的活细胞，也许技术的进步可使他们在以后得到挽救。 虽然克隆出来的动物个体具有完全相同的遗传结构，但他的意义在于： A生物学和医药研究。 B获得更多的优秀动物个体用于生产。 C成体细胞核移植的意义在于，他可以复制生产高价药物的动物。这也是克隆技术发展的动力所在。 英国科学家找到了叫羊、牛、兔子等动物产的奶中含有非常值钱的药物的方法。但是他们的后代却不在有这样的能力，因为遗传物质发生了变化。现在看来，克隆-成体细胞的核移植是一个很好的解决问题的方法。 克隆有多种方法：有一些克隆是天然的。比如同卵双胞胎，就是一个胚胎，由于某种原因裂为两个，他们各自形成一个个体。胚胎切割也是一种克隆的方法。将一个有几十个细胞的胚胎切成两份、四份甚至八份，每份都可以成长为一个个体，他们的遗传结构是完全相同的。这是一个比较古老的技术，7-80年代就很成熟了。有技术高超者，左手拿放大镜，右手拿刀片就可以完成这个工作。胚胎细胞的核移植是一种方法。成体细胞的核移植又是一种方法。 多利的克隆是采用成熟体细胞作的克隆，由于他们发明了一种能使卵细胞与供体细胞的细胞周期同步化的方法，因此克隆多利的技术才成为可能如果两细胞分化周期不能同步，细胞核就不可能在正确的周期内进入卵细胞，被卵细胞接受，供体细胞必需经过某种处理进入G0期，即细胞静止期。 首先，一个来自供者的乳腺细胞必须被分离出来，并得到其遗传物质。因此，研究者们必须在体外将细胞分离培养，由此得到细胞核的大量复制体。此步骤仅在想要改变DNA时才有用，（如Polly，随后的一只转基因克隆羊的诞生），可用于观察外源基因的功能。 从培养液中取出的供体细胞随之置于特别的培养液中培养，此培养液仅含使细胞存活的物质，而无促进细胞生长分化的营养，因此，细胞将被迫关闭所有活性基因进入G0期。来源于黑色母羊的卵细胞被除去核物质，置于供体细胞附近。1-8小时后，利用电融合技术将两个细胞融合，同时激活胚胎细胞的发育。此过程模拟精子的激活过程，但并不是完全正确，因为在电刺激后只有极少部分活化的细胞能够存活到胚胎形成的时候。 如果胚胎能够存活，大约生长6天后，胚胎被注入另一只羊的输卵管中。实验中发现，细胞若更早就放入输卵管，将会比经过培育后再放置的细胞更容易存活。最后，胚胎将到达代理黑羊的子宫内着床。 新生的克隆羊与正常的新生羊完全相同，还必须观察多利或用这种方法克隆的其他动物是否会有长远副作用，如DNA慢性损害导致的癌症高危性和其他基因疾病。 有的克隆是采用两步核转移法，PPL公司的研究人员用这种方法克隆了五只小猪。猪的核移植其难度就在于难以得到发育得足够好的胚胎细胞。PPL公司的研究者们从以下四方面来解决他们的难题：卵细胞的激活，供体细胞的选择，胚胎的培养，以及受孕的诱导。 1、 卵细胞的激活：一般的物种，多采用MII期的卵母细胞作为受体，在此过程中，激活卵母细胞的方法是关键。PPL公司采用合体细胞作为胞质受体，可避开人工激活过程中的误差，而且成功可能性将更大。由于在移核过程中，受体细胞可能缺少某些必需物质，发育到后期的胚胎不易成熟。采用合子作为受体，其中含有原核所必须的营养物质，因而有可能更加成功。Kwon和Kono首先在小鼠体内完成此方法，将已接受核移植的卵母细胞在含细胞松弛素B的液体中激活，细胞松弛素防止极体的形成，同时卵母细胞将形成两个假原核。将假原核转入去核的在体内发育成熟的合子细胞中，然后置于代理母亲体内。 2、 细胞培养液的选择。由于不同的细胞系其培养要求差异较大，而核移植的细胞培养尚无公认配方。针对不同的细胞系其影响因素有如下几点：细胞代谢时的氧化损伤，基因组的不稳定及染色体病理。所有这些因素都受细胞分离和培养，及细胞的倍增系数的影响。PPL公司的研究者们经过比较后，采用粒层细胞作为供体细胞，粒层细胞在培养中所需的处理最少，使用的细胞未经冰冻处理。 3、 胚胎的形成。PPL公司的研究者采用以下方法（1）体内来源的原料，（2）尽量避免人工激活，（3）尽量缩短胚胎体外培养的过程，来使实验尽量成功。 PPL公司的胚胎形成采用两步法（改良的Kwon 和Kono方法）。第一步，受体细胞与体外培养并去核的MII卵母细胞融合。当第一次移核的卵母细胞生成假原核后，将之再次转移到体内生成的去核合体细胞中，此为第二步移植。将第二步移植的胚胎转移入融合两小时内同步的代理母亲输卵管中，代理母亲用PMSG（pregnant mare serum gonadotropin）和hCG（human chorionic gonadotropin）处理，诱导并保持怀孕状态。 这些技术能克隆动物，但克隆人呢？这是现在许多科学家正在讨论的问题。我认为只要谨慎地运用这一技术，那么克隆带来的好处使可能出现的社会问题变得微不足道。克隆的最终产物，如克隆牛，克隆鼠等都不是最重要的成果，克隆技术的应用应该促进整个科学和生活的质量，包括影响遗传学，细胞发育生物学，产科学等学科的研究。克隆人类并不是这一争论的关键，而只是对于继续进行克隆研究的威胁。正确运用克隆技术，可以为人类带来许多好处！！

药物临床试验质量管理规范，Good Clinical Practice（GCP）是 药物临床试验全过程 的质量标准，包括方案设计、组织实施、监查、稽查、记录、分析、总结和报告。 GCP适用于 为申请药品注册而进行的药物临床试验 。药物临床试验的相关活动应当遵守本规范。GCP概念的起源 ： 1、对 受试者权益保护 的关注：《纽伦堡法典》、《赫尔辛基宣言》的背景和意义； 2、对药物临床试验 重要性 的认知：磺胺酏剂事件、反应停事件；历史上发生过的 人体试验类型 ： 1、自体试验（探索真理的献身精神） 2、欺试验：在押犯人/触犯法律 3、强迫试验：日本731部队/纳粹德国集中营 4、天然试验：战争、天灾、瘟疫/回顾性研究，以防止更大的灾难发生 5、自愿试验：新药/新技术；健康人/适应症患者纽伦堡审判（1945-1949） 1、在纽伦堡，国际军事法庭对在集中营犯下暴行的纳粹医生进行了审判。 2、医学顾问Leo Alexander等撰写了6项条款以判定医学研究的合法性。 3、法庭在此基础上添加4条，判定纳粹医生犯有“非人道罪” 4、法庭审判的解释形成了《纽伦堡法典》： 第一部有关人体研究的国际伦理指南（1947） 5、纽伦堡法典产生的背景： （1）二战期间，德国纳粹分子借用科学实验和优生之名，用人体实验杀死了约600万犹太人、战俘及其他无奉者，这些人被纳粹统称为"没有价值的生命"； （2）为首分子被作为战犯交组伦堡国际军事法庭审判，其中有23名医学方面的专家和教授； （3） 纽伦堡法庭的审判首次形成了人体试验的基本原则，并作为国际上进行人体试验的行为规范。 6、《纽伦堡法典》十条 （1）其中最重要的有两条： 一是 “受试者的自愿同意是绝对必要的” ，并解释了知情的要素：在受试者决定参加试验之前，应让其知道试验的本质、持续时间和试验目的；试验的方法和手段都有哪些；可合理预见的所有的不便和危险；参加试验对其健康或其个人的影响。 二是强调试验 对社会要有益 ，同时 强调试验的危险性不能超出人道主义的重要性 。 （2）规定试验中止的原则： 当科研人员判断继续试验对受试者会带来伤害，必须随时中止试验；如果受试者在肉体和精神上已经达到继续进行试验对他而言不太可能承受的情况下，应停止试验。20世纪涉及伦理的重要事件： 1、“Tuskegee Trial"： 梅毒：1932年；美国阿拉巴马州；自然病程观察； 600例男性黑人，399例阳性：6个月/40年：100人死于梅毒并发症/40位妻子感染/19例新生儿染病：Belmont报告发表（ 知情同意和IRB诞生，只做了自然观察，没有对疾病进行干预 ） 2、“反应停事件”： 沙立度胺：1959年：德国：海豹样骑形婴儿； 伦兹博士：1961年发表论文“畸形的原因是药物反应停”：15个国家：12000多名； 赫尔辛基宣言 （基于“反应停”和“梅毒”事件而产生）（ 科学认知局限性 ） 美国科学杂志《月球》列为20世纪十大科学错误之一 西德伦兹博士1961年发表论文“畸形的原因是反应停” 药品安全监管史上的分水岭和转折点 ：世界各国政府充分认识到，应 通过立法来要求药物上市前须经过临床试验来评价安全性和有效性 ，以及赋予药品监督管理部门审批新药的权力和行使强制性监督检查的职能。 FDA历史上的女英雄弗朗西斯凯尔西全球GCP概念的起源与临床试验研究息息相关 1、1938年：“磺胺酷剂事件”引起美国政府高度重视， 成立FDA 加强对药品上市的监督管理。 2、1947年：英国国立研究委员会提供临床试验专项基金。 3、1952年： A B分别在《英国医学杂志》和《新英格兰医学杂志》发表题为临床试验的论文。 4、1952年： H在《美国医学杂志》发表以人为研究对象的论文。 5、1960年：“反应停灾难”促使各国政府加强药物上市前安全性监督，强调动物毒性，试验研究。 6、1964年：第十七次世界卫生大会（WHA 17）作出决议，要求各国卫生负责人制订评价药物安全有效性指导原则。 7、1969年： WHO发表技术报告（），对临床前药物安全性试验、药物致畸试验、药物致突变试验、药物致癌试验、药物成癌性评价、药物临床评价及药物国家监督等 提出原则性意见与建议。