食管癌综述论文参考文献

2021年9月6日，清华大学王建斌团队和中国医学科学院肿瘤医院吴晨团队的研究人员在  Nature Communications  上发表关于单细胞转录组分析揭示食管鳞状细胞癌的肿瘤微环境的文章，研究人员采用单细胞转录测序技术对60例食管鳞状细胞癌患者的肿瘤组织和4例正常组织进行单细胞测序，揭示了食管鳞状细胞癌肿瘤微环境中的免疫抑制状况，为深入了解食管鳞状细胞癌的发病和进展机制提供了基础。 接下来我带大家一起走进这篇文章深入了解作者的研究思路及主要结论。 【发表期刊】 Nature Communications  【发布时间】 2021年9月6日 【影响因子】 研究背景 食管癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，是全球第七大常见的癌症。据统计，我国食管癌发病率和死亡率呈快速上升趋势，而食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma , ESCC）占我国食管癌总数的90%以上，ESCC 的5年生存率约为20-30%，这可能是由于早期诊断困难和缺乏有效治疗引起的，因此剖析 ESCC 肿瘤微环境（Tumor microenvironment , TME）的细胞组成及变化，对于建立早期诊断和创造有效的治疗至关重要。 在过去的几十年中，已有许多关于 ESCC 转录组学研究报道，但之前的研究是依赖于 cDNA 微阵列或 Bulk 测序，不能说明在异质性肿瘤组织中的细胞动态变化。单细胞转录组测序是近年来发展起来的一种有效方法，已被证明能够对异质性肿瘤组织进行分析，并破译肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用。所以阐明 ESCC 的转录组特征和微环境成分，对制定有效的早期诊断和治疗策略是非常重要的。 ·研究思路 ·研究结果 01、 绘制 ESCC 肿瘤微环境图谱 对60例 ESCC 患者的肿瘤组织和4例正常组织进行单细胞转录测序（CD45-细胞）和 TCR 测序（CD45+ 细胞），并使用经典的 marker 基因进行注释（图1a）。从 CD45- 细胞中鉴定了8个主要细胞群：上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和周细胞，在 CD45+ 细胞中鉴定了 T 细胞、B 细胞和髓样细胞。与正常组织相比，ESCC 肿瘤组织有更多的上皮细胞和周细胞，但成纤维细胞较少（图1b，1c）。02、 上皮细胞的瘤内和瘤间异质性 作者先研究 ESCC 中上皮细胞的表达状态，将52个患者的上皮细胞重新聚类分成38个亚群（图2a），并分析每个亚群在不同患者的比例，发现其中24个细胞亚群（≥75%）来自单个患者，而其他14个亚群则由多个患者构成（图2b）。作者将上述24个亚群定义为第1组亚群，另外14个亚群定义为第2组亚群。比较每名 ESCC 患者的上皮组成成分，发现其中21例患者的 ESCC 主要由第1组亚群组成，31例患者由第2组亚群组成（图2c），另外使用 PCA 分析上皮细胞在肿瘤内和肿瘤间的异质性（图2d），上述结果表明 ESCC 广泛存在肿瘤内和肿瘤间异质性且是正相关（图2e）。同时发现第1组亚群比第2组亚群具有更高的肿瘤间异质性（图2f）。03、 ESCC 上皮细胞中八种常见表达程序 为了研究多个样本之间上皮细胞的共表达程序，对每个样本内部重新进行聚类分成274个亚群（图3a）。基于每个亚群的 top30 基因进行层次聚类分析，共鉴定了8个具有不同功能和细胞状态的表达程序（图3b）。通过 GSVA 对表达程序细胞进行富集分析，发现不同的表达程序具有不同的生物学功能（图3c），通过相关性分析不同表达程序之间的相互作用，确定了5个显著的共现程序，Epi1 与 Epi2 高度共存，反映了 Epi1 和 Epi2 对上皮细胞分化的需求，Epi1 也与循环程序同时发生，反映了 Epi1 对细胞生长和增殖途径的激活。Epi2 程序与粘膜程序高度共存，表明粘膜免疫存在于分化良好的上皮细胞中（图3d）。最后对8个表达程序进行打分以及对患者进行聚类，发现每个表达程序在 ESCC 患者之间高度不均一，大多数 ESCC 患者表达不止一个程序（图3f）。04、 ESCC 的免疫抑制型肿瘤微环境 由于 T 细胞是 TME 中最丰富的肿瘤浸润淋巴细胞，因此重新聚集分析69278个 T 细胞，共分成9种不同的细胞亚群，与正常组织相比，ESCC 的 TME 中富含调节 T 细胞和耗竭 T 细胞，缺少初始、效应和记忆 T 细胞，表明 TME 处于免疫抑制状态（图4a）。与 I 期肿瘤相比，II/III 期 ESCC 的衰竭和 Treg 评分显著升高，说明 ESCC 的 TME 免疫抑制状态随着肿瘤进展而恶化（图4b）。另外 TCR 分析显示，TCR 克隆型组成和增殖细胞比例在不同的 T 细胞亚型中高度不同，耗竭 T 细胞具有最高的克隆扩增水平和增殖细胞比例（图4c，4d）。 由于肿瘤相关巨噬细胞（Tumor associated macrophages , TAMs）已被证明是调节先天性和适应性免疫反应以及促进肿瘤血管生成、侵袭和转移的基础，因此对19273个髓系细胞重新分群成11种不同的细胞亚群（图4e），发现单核细胞和 TAMs 不仅表达与免疫抑制相关的基因（ TGFB1  和  COX2 ），而且还表达与血管生成相关的基因（ VEGFA 、 CXCL8 、 MMP9 和  MMP12 ）（图4f）。树突状细胞（Dendritic Cells , DC）有三种不同的细胞亚型：经典 DC (cDC)、耐受性 DC（tDC）和浆细胞样 DC（pDC），其中免疫检查点基因 PD-L1、PD-L2 和 IDO1 在 tDC 中表达量最高（图4g），另外 ESCC 显著富集 tDC，且 PD-L1、PD-L2 的表达高于与正常组织（图4h）。另外从一名 ESCC 患者组织中分离的 tDC 与人外周血的 CD8+ T 细胞共培养，发现 tDC 显著抑制 CD8+ T 细胞的增殖，在加入 PD-L1 抗体后，可恢复 CD8+ T 细胞的增殖和活化（图4i，4j）。上述结果表明 tDC 在 ESCC 免疫抑制微环境中起着至关重要的作用。05、 ESCC 基质细胞的互作和分化 成纤维细胞和周细胞可通过周细胞-成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，是 TME 的重要的组成部分，可促进肿瘤侵袭和转移。因此作者将成纤维细胞和周细胞重新聚类分为9个亚群（图5a）。这些成纤维细胞亚群具有不同的标记基因和通路活性，NMF 表达编码蛋白酶抑制剂相关的的基因（SLPI 和 PI16），NAF1/2 表达与伤口愈合反应相关基因（IGF1、C7 和 APOD），CAF1 和 CAF2 表达促炎趋化因子（CXCL1 和 CXCL6），另外 CAF1 也高表达（CCL2、CCL11 和 CXCL14）, CAF2 高表达活化周细胞的细胞因子（CXCL5 和 CXCL8），CAF3 和 CAF4 则高表达肌成纤维细胞的标志基因（TAGLN 和 ACTA2)（图5b）。另外作者发现成纤维细胞两种不同发育轨迹，在一个分支中发现从 NMF 到 NAF1/2、CAF1、CAF3 和 CAF4 的分化轨迹，另一个分支发现周细胞、CAF2 和 CAF4 的分化轨迹（图5c）。基于分区的图抽象（PAGA）分析不同亚群之间相互作用，发现 CAF1 与 NAFs 和 CAF4 相关，而 CAF3 则是与 CAF2 和 CAF4 之间的联系更加密切（图5d）。与正常组织相比，肿瘤组织中高 CAF2、CAF3、CAF4、周细胞和血管平滑肌细胞，其中 II/III 期 ESCC 比 I 期表达更多的 CAF3 和 CAF4（图5e）。上述结果表明在 ESCC 微环境中，CAFs 的积累可能在肿瘤进展中起关键作用。 由于内皮细胞（Endothelial Cell , EC）在 TME 中经常表现出异常的表型和功能，这可能会限制它们对抗血管生成疗法的反应，因此将11267个内皮细胞重新聚类为6个亚群，包括3个正常 EC（NEC1-NEC3）和3个肿瘤 EC（TEC1-TEC3）（图5f），通过聚类热图发现 TECs 具有特异性激活的通路，包括细胞增殖、血管生成、TGF-β 信号传导、EMT 和能量代谢（图5g）。另外 TECs 高表达与血管生成相关的分子（VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3和PDGFB），但与细胞粘附相关的基因（ICAM1 和 VCAM1）表达水平则低于 NECs（图5h）。 PDGFB-PDGFRB 信号通路在周细胞-肌成纤维细胞转化中起着关键作用，且 PDGFB 主要由内皮细胞分泌，通过配体-受体互作分析发现，TEC 和周细胞之间有很强的相互作用（5i），TEC 中 FDGFB 的表达水平与周细胞-内皮细胞比值、CAF2 和 CAF4 比例呈正相关（图5j，5k）。上述结果表明，TEC 可能通过诱导周细胞向肌成纤维细胞的转化，促进肿瘤血管生成，从而促进肿瘤进展。·研究结论 本研究对60个 ESCC 患者和4例正常组织的208659个单细胞转录组数据进行分析，揭示了 ESCC 的 TME 组成。阐明了肿瘤细胞和 TME 细胞之间可能的相互作用以及 TME 中不同细胞类型之间的相互作用，这些结果揭示 ESCC 的 TME 免疫抑制状况，为深入了解 ESCC 的发病和进展机制提供了基础。 参考文献： ZhangX, Peng L, Luo Y, et al. Dissecting esophageal squamous-cell carcinoma ecosystem by single-cell transcriptomic analysis.  Nat Commun . https:2021;12(1):.

（一）发硒与食管癌死亡率的关系

本次测试的食管癌高发区—中发区—低发区健康人发硒依次为→→μg/g。虽然三者之间无统计学显著差异，但仍显示随高—中—低发区略有下降的趋势，发硒与食管癌死亡率略显正相关关系（图4-9）。与赵远维（1993）硕士论文报告中食管癌高、低发区人发硒数据对比（表6-12）后可以看出，本次测试的数据，普遍高于赵远维提供的数据，而且赵远维的结论高发区发硒低，低发区发硒高，与本次研究结论恰好相反。然而值得注意的是在他的数据中病人的发硒值却高达μg/g，与本报告正常人发硒值接近。其中服药病人和前期病变病人（未服药）发硒值分别为和μg/g。因此他认为是服药使病人发硒值增高。但即使按照他的数据也发现未服药病人发硒值比正常人高，这是难以令人理解的，而且也与他的结论矛盾。在这里，我们不去纠缠两家数据差异的原因，我们只是从上述重病区病人与正常人，服药与未服药病人发硒值的对比中认为，病人与健康人发硒水平不应该出现明显差异。四川西北部食管癌高发区病人（μ）和非病人（μg/g）发硒值相当接近的结果（王朝俊等，1990），亦说明我们的这一判断是存在可能的。本区如此高的人体硒水平和发硒与食管癌死亡率的不太明显正相关关系，特别是病人与非病人发硒一致水平都说明，硒不太像是食管癌发病的直接原因。

表6-12磁县及邻区发硒含量对照表μg/g

（二）食管癌病因与人体硒

人们普遍认为硒有抗癌作用，其主要依据有：①硒的抗氧化作用可保护细胞膜脂质不受氧自由基的损害使细胞发生畸变；②增强机体的免疫能力，提高抗体对癌细胞的抑制功能；③阻断化学致癌物质的诱变作用；④置换致癌物质分子，保护DNA不受破坏或对DNA进行修复（魏华臣，1985；贾永平，1989；顾公生等，1994）。从理论上说硒确实具有对某些癌症（包括食管癌）的抑制作用。而且在具体的研究中，也取得了许多重要进展。但是在实际应用中，仍然存在着不少悬而未决的问题，还未取得实质性的突破。

在本书第一章第四节和第四章第三节中，我们曾引用了本区相邻的河南林县食管癌病因研究成果，认为食管癌是多种病因综合作用的结果。其中人体内的亚硝胺（主要是NMBzA和MAMBNA）诱发食管组织中抑癌基因的突变丢失和上皮细胞原癌基因的激活，被认为是食管细胞组织癌变的主要原因。因此人们普遍认同亚硝胺和霉菌（可与亚硝胺结合成一种新亚硝胺MAMBNA）的致癌作用。在磁县，食管癌的发生理应与这一致癌作用相同。但问题是不论是磁县地区还是相邻的林县地区，对硒在食管癌变过程中的作用似乎都不是太清楚，而且出现了相互矛盾的现象。例如，①磁县地区癌症病人和正常人，重病区与轻病区人群发硒都处于同一较高水平；更奇怪的是重病区人群发硒反而比轻病区人群略偏高，这与同一太行山食管癌带中的鹤壁市食管癌区和其它地区食管癌区的结论正好相反（林英等，1992；王朝俊等，1990）；②朱明（1992）动物试验表明，硒酵母饲料中分别加入含、、μg/g硒的亚硒酸钠和等量NMBzA，分三组喂养大鼠，其食道Ⅱ级病变（乳头状病变或非典型性增生）发生率分别为、871%和；Ⅲ级病变（早期癌）发生率分别为、和，各组之间无显著差异；Nauss等（1986）动物试验证明，在NMBA诱癌过程中加入4μg/g的硒可降低癌的发生率；但在癌变启动后补充同样的4μg/g硒不但不降低癌的发生率，反而增加NMBA的致癌作用；魏崇文分别用亚硒酸钠和硒代二乙酸的不同浓度溶液体外培养肿瘤细胞，在选用的4种稀释浓度内，当每毫升培养液内含40微克的亚硒酸钠时（实际上为μg/ml硒）对所有的癌细胞有明显的杀伤作用；而硒代二乙酸的浓度为1500μg/ml时，才能阻止癌细胞的生长；所以硒对癌细胞作用的强弱决定于硒的化学形式和剂量；试验表明40μg/ml的硒，不论对癌细胞还是猴肾细胞都有杀伤作用，在杀伤癌细胞的同时，正常细胞也受损害，亚硒酸钠毒性远大于硒代二乙酸；杨光圻（1990）也发表了相似的观点，认为硒的抑癌作用大都接近中毒剂量；恩施高硒中毒地区各种癌症死亡率低，恰好证明这一点；③中美双方在我国林县食管癌高发区进行长达6年的人体随机干预营养试验发现，人体补充50μg/d硒以及维生素E和β－胡罗卜素，可使胃癌死亡率降低20%，但对食管年死亡率降低不明显（黎钧耀，布洛特，李冰等，1993）。

以上实验和统计数据表明，①硒只有在一定的浓度指标以上才能起到阻止亚硝胺对细胞的癌变作用；按照Nauss的试验，＞4μg/g的硒才能抑制亚硝胺对细胞的诱变，魏崇文则提出＞40μg/ml的亚硒酸钠溶液（μg/g硒）能杀伤癌细胞；朱明的试验，可能加入的亚硒酸钠过低，致使三组大鼠都发生癌变，且发生率相差不大；②在相同剂量的无机硒和有机硒作用下，无机硒对癌细胞杀伤作用和抑制作用大得多；因此在正常情况下，人体吸收的粮食硒和体内储存的硒基本上为有机硒，它们对癌细胞的抑制作用以及对亚硝胺的阻断作用似乎都不太强，都不如直接加入无机硒化物作用显著；③4μg/g硒只对亚硝胺诱变细胞阶段起抑制作用，一旦癌变启动，同样的硒不但不起抑制作用，反而会刺激癌细胞生长，但是＞40μg/ml的亚硒酸钠溶液（硒＞μg/g）却能杀伤癌细胞。

用以上三点结论对照磁县地区，在正常情况下，摄入的粮食硒～μg/g。如果没有更多硒加入，显然对亚硝胺诱发癌细胞作用的抑制效果不大。只有使摄入的硒加大到4μg/g以上时，才能起到抑制亚硝胺诱发癌细胞的效果。在这种限制下，磁县地区不管是高发区还是低发区的粮食硒（～μg/g）和发硒（～μg/g）都处于同一相对低硒的水平（显然这种级别划分不适合谭见安等（1989）的划分标准）。由于摄入的粮食硒是有机硒，在膳食中加入50μg/ml硒，虽不一定比得上40μg/ml亚硒酸钠溶液对癌细胞的杀伤作用。但仍造成干预试验中硒组合试剂在降低了20%的胃癌死亡率的同时，也使食管癌死亡率略有所下降，而不致于继续上升。致于为什么造成胃癌死亡率下降而对食管癌影响不大？这涉及到进一步的抑制机理，以及硒在各器官中的分配和状态问题，还待进一步研究。化学致癌是化学物质（亚硝胺）诱发食管细胞组织中基因突变的结果，硒抑制亚硝胺的诱癌作用，是在癌变前期进行的。因此硒不是食管癌发生的病因，而是抑制食管癌发生的条件之一。之所以强调它是抑制食管癌的条件之一，是因为还有其它许多抑癌条件，如维生素C、维生素E、β-胡罗卜素，微量元素Mo、Zn、烟酸等。从目前的研究水平来看，需要包括硒在内的多因素协同作用才能对亚硝胺的致癌作用起到较好的抑制效果。