人类食管癌MMP3论文

单细胞测序分析CD45+的细胞（免疫细胞）→利用经典标记对免疫细胞注释，研究免疫细胞的成分差异→阐明免疫细胞改变的分子机制→研究免疫细胞TCR序列的变化，克隆性，说明起源问题→研究髓系细胞，TAMs（肿瘤相关巨噬细胞），WCGNA研究细胞分子特征→细胞间相互作用（scTHI）

我们获得了一个详细的单细胞分辨率的食管鳞状细胞癌（ESCC）免疫细胞图谱。阐述了哪些免疫细胞处于休眠状态，哪些免疫细胞处于增值状态，以及这些细胞与免疫抑制之间的关系。

①食管癌在组织学上可分为两个亚型：腺癌（EAC）和鳞状细胞癌（ESCC）。食管鳞癌是食管癌的主要亚型，约占全世界食管癌的90% ②最近，PD-1抗体用于晚期食管癌一线化疗失败的患者显示，与化疗相比，总体生存率只有中度的改善。 ③我们用高维（high-dimensional）scRNA序列分析了从七个切除的食管鳞癌肿瘤及其邻近组织中分离的总免疫细胞。同时进行T细胞受体（TCR）测序，以获得T细胞克隆性的信息 ④相较于癌旁正常组织，肿瘤组织T细胞明显扩增。 ⑤我们在这些肿瘤中发现了耗尽的T细胞、耗尽的NK细胞、调节性T（Treg）细胞、交替激活的巨噬细胞（M2）和耐受性树突状细胞（tDCs），表明ESCC中 存在炎症但免疫抑制的TME 。 ⑥我们鉴定出了一个与预后相关的基因集

①我们分析了从7对新鲜、手术切除的肿瘤和ESCC邻近组织中分离出CD45+细胞进行单细胞测序。过滤后，共80787个细胞（每个样品3248-9078），中位基因数1170个。 ②我们将所有样本的单细胞数据进行标准化和汇总，并进行无监督聚类以识别可区分的群体，用的是 ③我们利用典型标记对这些细胞进行了注释；这些细胞类型的经典标记物的表达与注释一致

④我们发现肿瘤中的t细胞和单核/巨噬细胞增多。与此相反，B细胞和NK细胞的百分率降低

（S133、S134和S150）--在这些肿瘤中，T细胞所占的比例不到总细胞的2%。 （S135、S149、S158、S159）--这些肿瘤中，免疫谱在PCA中呈现显著变化，其中6–12%的细胞是T细胞。

①T细胞和NK细胞是TME中主要的细胞毒性免疫细胞，我们对来自所有样本的T细胞和NK细胞进行无监督聚类，我们鉴定了6个CD4 T细胞簇，7个CD8 T细胞簇，1个CD4和CD8双阴性T细胞簇和3个NK细胞簇

②在T细胞中，我们使用已知的功能性标记来提示CD4 T细胞群，包括天真、记忆、效应、耗尽的T细胞和Tregs。这些标记物还鉴定了CD8T细胞群，包括记忆、效应、细胞毒性和耗尽的T细胞。

④我们进一步分析了与GFBP2、LAG3和FOXP37表达高度相关的基因。前50个基因用于细胞毒性、衰竭和Treg的分配。然后我们使用这些特征分析T细胞簇，发现富集分数与公布的特征一致。 ⑤CD4群体中存在着谱系联系，exhaustion和Treg评分的可视化证实了这两个簇之间的重叠 ⑥细胞毒性和耗尽的CD8 T细胞都表达许多效应分子，如GnY和GZMH，而耗尽的DCD8 T细胞表达的IFNG水平高于细胞毒性细胞（图2f），这表明耗尽的T细胞仍表达高水平的某些效应分子并试图对肿瘤细胞作出反应； 这些结果提示CD8-C5-CCL5处于衰竭早期，CD8-C7-TIGIT处于衰竭期，CD8-C6-STMN1可能是CD8-C5-CCL5与CD8-C7-TIGIT的过渡期。

①我们比较了肿瘤和邻近组织中的T细胞簇。CD45+细胞中的 （Treg cluster CD4-C6-FOXP3） and （exhausted CD4 T cells CD4-C5-STMN1 ）的百分比与匹配的邻近组织相比显著增加； 流式细胞术也证实了在ESCC肿瘤中Tregs的富集。 同样，耗尽的cd8t细胞在肿瘤中富集。

②在ESCC中，PD1在CD8 T细胞中的表达一直较高（图3f）。肿瘤组织中Tregs和耗尽的DCD4和CD8 T细胞显著增加表明存在免疫抑制环境 ③我们还观察到，与匹配的邻近组织相比，肿瘤组织中的NK细胞显著减少； NK-C1-NCR3表达高水平的NCR3、CD266、NKG7和LAMP1（图3h）。 相反，NK-C3-KLRC1和NK-C2-STMN1簇高水平表达KLRC1和ITGA1抑制性受体（图3h）。 流式细胞术分析证实，与邻近组织相比，ESCC中NKG2A（KLRC1）在NK细胞中的表达增加（图3i）。事实上，NK-C3-KLRC1和NK-C2-STMN1的细胞毒性分数极低；相反，衰竭分数升高（图3j），这表明在ESCC中NK细胞不足，功能受损

①根据TCR结果我们共观察到15654个独特的tcr序列。观察到克隆扩展，克隆大小从2到2600（图4a）。 如预期的那样，患者之间没有发现共享克隆。与其他癌症类型的研究一致，大多数TCR是独特的。然而，TCR基因型的组成在患者中是高度可变的

②S149和S150肿瘤中有65%和68%的T细胞具有两个以上细胞共用的TCR，这表明这些肿瘤中T细胞的高度克隆性扩增（图4b）。与匹配的邻近组织相比，7名患者的肿瘤中有4人的扩增克隆数增加。

④CD8 T细胞的克隆性细胞明显多于CD4 T细胞，并且幼稚的CD4-C1-CCR7簇显示出非常有限的克隆性扩增（图4d）。 ⑤CD8-C1-NKG7是CD8 T细胞中的细胞毒性簇，在邻近组织中具有较高的频率，在邻近组织中也显示出比肿瘤组织中更高的克隆扩增（图4e）。

⑥然而，与邻近组织相比，肿瘤中的Tregs克隆数增加（图4f），这表明特异性克隆细胞的扩张可能是肿瘤中Tregs高百分比的原因。 ⑦我们在CD4细胞的所有簇（包括Tregs）和CD8细胞的所有簇（C2除外）中发现了TCR序列的共享（图4g，h） ⑧CD8-C7-TIGIT与CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1共有的克隆数分别为166（）和156（）（图4i）。 ⑨Treg簇CD4-C6-FOXP3在肿瘤中也有相同的趋势，与CD4-C1-CCR7共有的克隆型占，在邻近组织中占（图4j和补充图8c）

①接下来，我们对髓系细胞进行无监督聚类。十四个簇被鉴定，包括9簇单细胞/巨噬细胞和5簇树突状细胞（图5a）。 ②利用已发表的信号特征：单核细胞（Mono）、经典活化巨噬细胞（M1）、交替活化巨噬细胞（M2）和髓源性抑制细胞（MDSCs）； ③我们使用Monocle，一种无监督的推断方法，来构建细胞转化的潜在发展轨迹。另一种算法Slingshot的结果（s9b）； 巨噬细胞中M1和M2信号之间的显著相关性（补充图。9c），表明ESCC中存在一个复杂的巨噬细胞极化过程，这与其他研究一致 Mono-C1-VCAN显示出强大的单核细胞信号（图5b）。

④我们用wgcna对单核/巨噬细胞进行加权相关网络分析 我们发现绿松石模块与单核细胞簇、单核细胞C1-VCAN和单核细胞C2-IL1B正相关，与M2簇宏C3-CSF1和MDSC簇MDSC-C1-C1QC、MDSC-C2-APOE负相关（图5d，e）;我们进一步分析了这个模块中的基因以及它们与Mono-C1-VCAN的关联（图5f），以选择最相关的前50个基因，形成一个特征集； 有趣的是，这一特征与ESCC（图5g）以及宫颈鳞状细胞癌和肺鳞状细胞癌（补充图9g）的高无进展生存率密切相关，这表明这一特征可作为ESCC和其他组织鳞状细胞癌的预后生物标志物。

①五个DC簇表达热图（图6a）;DC-C3-LAMP3癌旁组织中富集（图6b）。

②发现LAMP3+DC与其他树突状细胞亚群相比具有更高的活性和迁移能力，同时其还富集到了耐受性特征（图6c）

④流式显示：LAMP3+DC表达的CD83、CCR7和PDL1明显高于LAMP3 DC（图6e，f）、提示LAMP3+DCs的成熟、迁移和调控能力。 ⑤多色ihc染色也证实了肿瘤组织中CD11C+LAMP3+PDL1+IDO+DCs的存在（图6g）。 ⑥我们进一步用IFNγ和LPS治疗dc。有趣的是，我们发现IFNγ和lps刺激诱导dc表达PDL1和IDO（图6h）； 当DCs与CD4+CD45RA+幼稚T细胞共培养时，诱导FOXP3表达的能力增强（图6i）。 提示IFNγ和LPS可能在体外诱导耐受性DCs

①我们基于已知配体-受体对在任何两种肿瘤浸润性免疫细胞中的共同表达，对潜在的细胞-细胞相互作用进行了系统分析 scTHI--另一种广泛使用的方法--分析巨噬细胞和Tregs的相互作用 ②我们发现巨噬细胞和Tregs之间TNF-TNFSF1B、CCL4-CCR8和IL-1β-IL1R2的相互作用具有较高的相互作用得分，并且Tregs在肿瘤中表达高水平的TNFSF1B、CCR8和IL1R2（图7a–c）

③肿瘤中分离的树突状细胞中IL1R2的表达高于癌旁组织，多色IHC也证实了IL1R2在Tregs中的表达。（图7d）

通过scrna-seq分析巨噬细胞中LILRB1的表达，并通过FACS进一步验证。我们发现，与邻近组织相比，ESCC中巨噬细胞中LILRB1的表达增加（图7h，i和补充图7）。

①在这里，我们结合了深链RNA序列和TCR序列，并阐明了整个免疫景观，包括ESCC和邻近组织中固有的和适应性的免疫细胞图谱；描述了ESCC免疫细胞的分类、比例、功能变化及机制、细胞间相互作用 ②ESCC富含免疫抑制细胞：Tregs, exhausted CD8 T,CD4 T and NK cells, M2 macrophages, and tDCs；促进免疫逃避和肿瘤进展 ③我们证明耗尽的CD4、CD8 T细胞和NK细胞是主要的肿瘤内增殖免疫细胞室，尽管这些细胞富含耗尽基因。 与耗尽簇（CD8-C7-TIGIT）相比，预耗尽簇CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1可能是更好的免疫治疗靶点，因为耗尽簇处于永久性和不易逆转的耗尽阶段，由于其表观遗传变化，使其更耐检查点抑制。 ④发现肿瘤浸润的NK细胞不仅在ESCC中普遍减少，而且还表达高水平的检查点分子，包括NKG2A和CD49d，提示处于耗尽状态；据报道，抗NKG2A和抗CD49d是促进抗肿瘤活性的检查点抑制剂 ⑤T细胞的TCR序列共享，提示T细胞启动后有着广泛的分化。 ⑥衰竭的CD8 T细胞（CD8-C7-TIGIT）与其他CD8簇具有更高比例的共享克隆，尤其是衰竭前簇CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1，这与这些簇的相关状态和多步衰竭假说相一致。 相反，CD8-C1-NKG7是细胞毒性最强的CD8 T细胞簇，在肿瘤中克隆性T细胞明显减少 最近在膀胱癌中也有类似的发现，细胞毒性cd8t细胞（FGFBP2+clusterin）在正常组织中的克隆性比在膀胱癌中的克隆性强。 另一方面，食管细胞毒性细胞的克隆扩增可能是由于食管中的非肿瘤抗原的偶然暴露，并且相邻组织中的大多数CD8-C1-NKG7细胞表达低水平的CD39，这表明它们是旁观者CD8 T细胞。 幼稚的CD8 T细胞可能不常渗入食管或被局部环境激活，因此不太可能被检测为独立的群体。 ⑦单核细胞/巨噬细胞在肿瘤中的关键作用已经在肝癌、乳腺癌和肺癌中用scRNA-seq进行了描述； 通常，巨噬细胞的活化分为炎症前M1状态或与炎症溶解相关的M2状态； 我们的分析显示单核细胞/巨噬细胞存在于单核细胞、M1和M2状态的光谱中；M1相关基因和M2相关基因经常在同一细胞中共同表达；M1和M2信号的共存表明TAMs比经典的M1/M2模型更复杂，这种现象在乳腺癌和肝癌中也有发现 当使用WGCNA分析单核/巨噬细胞的基因相关性时，我们发现一组基因与单核细胞呈正相关，在ESCC和其它类似的病理类型肿瘤有着较好的预测预后能力 ⑧cDC2特别参与MHCⅡ类介导的抗原提呈和cd4t的活化和扩增细胞.cDC1也是抗肿瘤免疫所必需的。最近，一些文献报道了TME中的DCs，发现大多数与我们的数据一致。 比较了不同癌肿之间的这种差异，对分析出来的细胞做了些功能分析。 ⑨我们的工作进一步证实了树突状细胞与巨噬细胞之间的相互作用； 在Treg上表达的IL1R2可能通过阻断IL1β依赖性效应T细胞的活化而增强Treg的功能; IL1R2在活化的肿瘤树突状细胞上表达，并与肺腺癌的预后不良相关。 我们的研究还表明，Tregs可能通过hhla-A、B、C和LILRB1相互作用调节巨噬细胞的功能。 研究TAMs中这种免疫抑制MHC类I-LILRB1信号轴的机制将有助于开发恢复巨噬细胞功能的疗法。 总之，我们的ESCC和邻近组织免疫细胞的转录图谱提供了一个了解免疫状态的框架，并揭示了ESCC环境中免疫细胞的动态特性。此外，我们还从多个方面阐述了食管鳞癌的免疫抑制状态，这些都是食管鳞癌及其他癌症免疫治疗的潜在新靶点

TCR测序方法简介 TCR测序干货 WGCNA

shí guǎn ái

esophagus cancer [中医药学名词审定委员会.中医药学名词（2010）]

食管癌（esophagus cancer[1]）是指发生于食管的癌病[1]。是发生于食管黏膜上皮的恶性肿瘤[2]。全世界每年约30万人死于食管癌[2]。我国是食管癌的高发区之一，在全国恶性肿瘤死亡总数中占，仅次于胃癌，居第二位[2]。在我国以华北地区发病率最高，河南省林县占首位[2]。我国食管癌发病率男性高于女性，但高发区男女比例接近，发病年龄多在40岁以上[2]。食管癌多发生于食管中段，约占50%以上[2]。

食管癌是人类较常见的恶性肿瘤之一，它严重威胁着人民的生命和健康。全世界每年约30万人死于食管癌[2]。

食管癌的发病率有明显的地理特点，甚至相邻的两地区，其发病率有明显的差异。

从全世界范围看，高发区分布在伊朗、南非、罗得西亚及中国，而欧洲、美洲、大洋洲、亚洲的以色列平均发病率很低，大多在5/10万以下。

我国是食管癌的高发区之一，在全国恶性肿瘤死亡总数中占，仅次于胃癌，居第二位[2]。在我国以华北地区发病率最高，河南省林县占首位[2]。在我国食管癌占各种恶性肿瘤首位的有9个省，华北三省，四川省和广东等省都有一个明显高于周围地区的高发中心，如华北食管癌的主要集中在太行山南段交界地区，其发病率超过130/10万。是该地区男性和女性死亡的主要原因。而距太行山不远的其它县，食管癌的死亡率降至2/10万以下。广东发病最高的是南澳岛。四川主要集中在川西北的盐亭、阆中及南部三县交界地区。此外，山东、江苏、福建、安徽、湖北、陜西及新疆等省也有食管癌相对集中的高发区，已查明有20多个县市食管癌平均年死亡率超过100/10万。

我国食管癌发病率男性高于女性，但高发区男女比例接近，发病年龄多在40岁以上[2]。

食管癌的病因包括：

亚硝胺类如亚硝酸盐、亚硝胺等[2]；

黄曲霉菌毒素等；③微量元素缺乏：钼、铁、锌、硒等[2]；

维生素A、维生素B2、维生素C等[2]；

烟、酒、热食、热饮、食物粗糙等[2]；

遗传易感因素[2]。

食管癌多发生于食管中段，约占50%以上[2]。

食管癌发生于食管粘膜上皮的基底细胞，绝大多数是鳞状上皮癌（95%），腺癌起源于食管者甚为少见，多位于食管末端。贲门癌多为腺癌，也可延伸侵入食管。

（1）隐伏型：食管粘膜仅有轻度充血或粘膜粗糙，肉眼不易辨认只能用脱落细胞学和组织切片作为诊断依据，全部为原位癌，为食管癌的最早期。

（2）糜烂型：粘膜表面有非常浅的糜烂，形状大小不一，边界分界清楚，状如地图。癌组织分化较差，原位癌与早期侵润各占一半，比第一型发展的晚。

（3）斑块型：表面粘膜稍隆起，高低不平，皱褶消失，似年皮癣样，病变范围大小不一，比前型发展的更晚，大约原位癌占1/3，早期侵润癌占2/3。

（4） *** 型：肿瘤形成明显的硬结，有的如 *** ，有的象带短蒂的息肉形，向腔内突出，癌细胞分化较好，绝大多数是早期侵润癌，是早期癌最晚的类型。

根据X线检查与病理大体所见，将食管癌分为以下几种类型。

（1）髓质型：最为常见，约占60%，肿瘤常累及食管全层，并围绕管腔向腔内外生长，形成较大而不规则之管状肿块。

（2）蕈伞型：约占15%，肿瘤向粘膜表面生长，形成扁平肿块，累及食管周径的一部分，多向管腔内突出如蕈菇状，边界清楚。

（3）溃疡型：约占15%，肿瘤形成凹陷的溃疡，侵蚀部分食管壁，一般不产生管腔严重堵塞。

（4）缩窄型：约占10%，癌肿形成环形或短管形狭窄，狭窄上方食管扩张。

（5）腔内型：较为少见，约占3%，癌肿呈息肉样向食管管腔内突出，有蒂与食管壁相连，表面有糜烂、溃疡、可侵入肌层。

贲门在解剖上属胃的结构，但发生恶性肿瘤时其诊断和治疗均与食管癌有许多共同之处，故将贲门癌亦纳入食管癌内叙述。贲门癌的大体病理分型分为如下几种：

（1）菜花型：肿瘤主要向管腔内生长，形成象"菜花"样之肿块。

（2）弥漫侵润型：肿瘤侵润范围较广，可累及食管及胃之大部，胃壁有增厚，粘膜有糜烂。

（3）溃疡型：肿瘤为大的溃疡，常穿入邻近脏器。

（4）混合型：多为晚期病变，已不能按以上分型。

食管癌早期症状不明显，一般无吞咽困难，可出现咽食哽噎感，食物通过停滞感，食管内异物感以及胸骨后烧灼样、针刺样疼痛[2]。中、晚期食管癌出现典型症状：进行性吞咽困难[2]。

早期食管癌变演进的分子机制尚不清楚，缺乏敏感、特异性的早期诊断指标和方法[2]。目前食管癌诊断方法主要为[2]：

饮食习惯，高发地区等[2]。

早期症状不明显，一般无吞咽困难，可出现咽食哽噎感，食物通过停滞感，食管内异物感以及胸骨后烧灼样、针刺样疼痛。中、晚期食管癌出现典型症状：进行性吞咽困难[2]。

常规X线钡餐检查常不易发现浅表性小癌灶[2]。

早期病例阳性率可达90%～95%，适用于普查或早期诊断[2]。

对临床高度怀疑而又未能明确诊断者，应尽早作食管镜检，并取活组织行病理确诊[2]。

EUS被认为是食管癌分期的金标准[2]。优点是可精确测定病变在食管壁内浸润的深度、测量壁外肿大的淋巴结、区别病变在食管壁的部位，为食管癌的后续治疗提供依据[2]。

由于食管癌以鳞癌为主，化疗不敏感，其化疗的地位仅用于晚期和手术后复发转移者，放、化疗联合以及放疗增敏[2]。食管癌受侵犯的淋巴结数量和脉管受侵是预后不良的独立因素，其接受化疗是有益的[2]。对年轻患者、病变广泛、多发病灶、残端阳性、局部淋巴结转移者，术后辅助治疗是必须的治疗手段，放疗联合全身化疗疗效好[2]。

20世纪60、70年代食管癌的化疗以单药为主。

常用药物有：丝裂霉素（MMC）、氟尿嘧啶（5FU）、替加氟（FT207）、多柔比星（ADM）、甲氨蝶呤（MTX）[2]。80年代顺铂（DDP）开始用于治疗食管癌，随后出现紫杉醇（PTX）等药物[2]。食管癌化疗无论腺、鳞癌，5FU和DDP都是基础的治疗药物，紫杉醇联合DDP方案也应用越来越广泛[2]。

其他对食管癌有效的药物：长春瑞滨（NVB），伊立替康（CPT11），吉西他滨（GEM）；分子靶向药物治疗对于食管癌具有重大的应用价值，目前发现的食管癌靶向药物包括Her2单克隆抗体曲妥珠单抗，针对表皮生长因子受体（EGFR）的靶向药物厄洛替尼，抗VEGF单克隆抗体贝伐珠单抗，以及环氧化酶2（COX2）抑制剂等[2]。

常用化疗方案[2]：

药物

用药剂量

用药方法

用药时间

用药周期

FOLFOX4方案

奥沙利铂（OXA）

85～100mg/（m2·d）

IV gtt 2h

Day 1

q14d

亚叶酸钙（CF）

200mg/（m2·d）

IV gtt 2h

Days 1,2

q14d

氟尿嘧啶（5FU）

400mg/（m2·d）

IV bolus 2h

Days 1,2

q14d

600mg/（m2·d）

CIV 22h

Days 1,2

q14d

PF方案

顺铂（DDP）

100mg/（m2·d）

IV

Day 1

q28d

或 20mg/（m2·d）

IV

Days 1～5

氟尿嘧啶（5FU）

1000mg/（m2·d）

96～120h

CIV

Days 1～5

q28d