儿科DSD论文

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基因克隆技术给人类生活带来美好的前景，故寄予了无限的期望。下面是我整理了基因克隆技术论文，有兴趣的亲可以来阅读一下!

差异表达基因克隆技术的新进展

提要 分离并克隆差异表达基因是 目前 功能性基因 研究 的热点。mRNA差异展示是筛选差异表达基因最有效的技术之一，它的主要不足是有一定假阳性。RDA、SSH、DSD、LSH技术能够克服假阳性，但也具有一定的不足，应根据需要选择运用。随着能扩增长片段及具有自动校正功能的Taq酶出现及 应用 ，这些技术将会不断完善与 发展 ，具有广阔的应用前景。

关键词 差异表达基因;克隆

现代 分子生物学研究表明，人类基因组约由10万左右的不同基因组成，这些基因选择性的表达决定了机体整个生命过程，基因表达的变化处于控制生物学调节机制的中心位置。因此，分离并克隆差异表达基因不仅有助于阐明生命的粤秘，而且还能为基因诊断与 治疗 提供重要的 理论 依据。近几年来，差异表达基因克隆技术不断完善与发展，已成为研究肿瘤和疾病等相关基因的重要手段。

一、mRNA差异展示

mRNA差异展示(mRNA differential display,DDRT-PCR)是目前筛选差异表达基因最有效的 方法 之一，其基本原理是：3´端采用锚定引物，与mRNA3´poly a结合，进行反转录，形成mRNA：cDNA杂交分子，5´端采用20条随机引物，与锚定引物一起进行PCR扩增，其产物经测序胶显示出来，再回收鉴定克隆差异条带。1992年Liang和Pardee[1]建立此技术时，5´端采用20条随机引物，每条由10个碱基组成，3´端采用12条引物即T12MN(M=A、C或G，N=A、G、C、T)。这种组合从统计学上几乎能完全覆盖所有的mRNA序列，差异表达的基因会全部呈现出来。实践证明，这种方法有效，但假阳性率在50%～70%左右，差异条带在Northern印迹上重现性差，后续处理也比较复杂。1994年Ito[2]等对3´端引物进行了改进，把12条引物改为3条，即T12A、T12C、T12G，使得实验操作简化。1995年Ayala[3]等提出了在3´端锚定引物与5´端随机引物上皆增加10个碱基，使得上下游引物Tm值在60℃左右，PCR循环参数也改为前5个循环采用Liang和Pardee推荐的参数，即94℃30s，40℃2min,72℃30s。经这样改进，显著地增强了差异条带的重复性和敏感性，同时使得差异条逼带的克隆十分方便。1996年4月，Liang和Pardee[4]对5´端此物进行了改进，引物条数改为8条，皆带上HindⅢ酶切位点，每条由13个碱基组成，3´端锚定引物采用3条，也带上HindⅢ酶切位点，每条由18个碱基组成，PCR循环条件仍采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,40个循环，最后在72℃延伸7min。1998年[5]我们在Liang和Pardee改进的基础上，对PCR循环参数进行了改进，即前5个循环采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,后35个循环采用94℃30s,55℃2min,72℃30s，最后在72℃延伸7min。经这样改进，既保持了扩增效率，又增强了差异条带的特异性及重复性，降低了假阳性率。

总之，mRNA差异展示具有简便、快速、所需起始材料少、同时可在多个材料之间或不同处理材料之间进行比较等优点，但具有较高频率的假阳性和短小的差异片段的缺点，给后续处理带来一系列 问题 ，虽然此技术经过了一些起改进，但这两个缺点仍限制着此方法的充分应用。

二、代表性差示 分析

代表性差示分析(representational difference analysis,RDA)最早由Lisitsyn等提出的。1994年，Hubank和Schatz[6]将其应用于克隆差异表达基因，其基本原理是：靶方(Tester,T)和驱动方(Driver,D)的cDNA在进行差方式分析前均用一种识别4碱基序列的限制酶作切割处理，形成平均长度为256bp的cDNA片段代表群，第一次T与D杂交反应时，两者总量比为1：100，第二次增加到1：400，第三次增加到1：8000，再利用PCR以指数形式扩增双链模板，而仅以线性形式扩增单链模板这一特性，通过降低cDNA群体复杂度和多次更换cDNA两端接头，来特异扩增目的基因片段。特别是T减D杂交反应后仅设置了72℃ 复性与延伸及95℃变性这两个循环参数，共20个循环，从而使PCR产物特异性大大提高。此技术最大的优势是差异条带在Northern印迹上重现性好，假阳性少。缺点是所需起始材料较多，更多信赖于PCR技术，T与D之间若存在较多差异，或T中存在某些基因上调表达，则难达到预期目的，而且工作量比DDRT-PCR大，周期长。

三、抑制性扣除杂交

抑制性扣除杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)，是1996年Diatchenk[7]等提出的一种新的克隆基因技术，其基本原理是：先将T与D方cDNA用限制酶切割为小片段，将T方平均分为两份，分别连接不同的接头，然后与过量的D方cDNA进行不充分杂交。根据复性动力学原理，浓度高的单链分子迅速复发，而浓度低的单链分子仍以单链形式存在。然后混合两份杂交样品，同时加入新的变性D方cDNA进行第二次扣除杂交，杂交完全后补平末端，加入合适引物接头(接头1与接头2引物)进行PCR扩增。当DNA两条链含相同接头时，其PCR扩增受到抑制，而含不同接头的双链DNA分子才可进行指数扩增，其产物即为目的片段。

此技术避免了消减杂交过程中分离单双链DNA的步骤，可成千倍地扩增目的片段，能分离出T方上调表达的基因，与DDRT-PCR相比，具有假阳性少重复性强的优点，它的最大不足就是需要较多的起始材料，更多依赖于PCR技术，不能同时进行数个材料之间或不同处理材料之间的比较。

四、差异消减展示

差异消减展示(differential subtraction display,DSD)是1998年Jose等[8]提出的，它是在DDTR-PCR呈现出差异条带之后，同时回收差异条带与对照方的相应范围的条带，靶方回收的差异条带用非生物素标记的引物与dNTPs进行PCR扩增，而对照方回收的差异条带用含生物素标记的dATP的dNTPs进行PCR扩增，其产物进行消减杂交，用链亲和素去除共有的产物，剩下的产物由带有α-32P dATP的dNTPs进行扩增，再重复差异展示，回收差异条带并克隆。此技术最大的优势是获得差异条带在Northern印迹上重现性好，假阳性少，敏感性强，可获得长片段，起始材料要求少，可获取低丰度差异表达基因，缺点是步骤繁琐，工作量大，周期性长，更多依赖于PCR技术。

另外，赵忠良博士把长片段PCR扩增(LPCR)与消并减杂交技术结合起来，建立了LPS技术，并运用此技术从抗原呈细胞中获取了170多个差异表达基因。此技术的基因原理是：T与D方分离出cDNA后，运用5´端帽子引物与3´端锚定引物，对cDNA进行大量扩增，其产物直接进行消减杂交，然后过柱子，去除相同的基因，剩余的部分再与D方cDNA进行二轮消减杂交，再过柱子，去除非差异部分，剩下的差异部分进行第三轮消减杂交，其产物进行分级分段克隆。这种 方法 最大的好处是：起始材料需要少，可获得差异基因，假阳性少，有可能获得全长差异表达基因。

总之，随着高效扩增的Taq酶与具有自动校正功能的Taq酶的出现，长片段PCR扩增技术的优化，差异表达基因克隆技术将会不断 发展 ，但 目前 主要有以上几种方法，各有其优缺点， 研究 者应根据自己的实际情况，选择合适的技术方法，以其达到自己预期的目的。

参考 文献

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2 Ito T et letters,1994;351:231

3 Ayala M et ;18(5):842

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7 Diatchenko L et Natl Sci USA,1996;93:6025

8 Jose RP et Biochemistry,1998;257:161

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米索前列醇（Misoprostol，Miso）是20世纪80年代人工合成的前列腺素E1衍生物，原用于治疗消化性溃疡，自1987年Rabe等首次提出Miso有终止早期妊娠的作用后，被广泛用于早孕药物流产〔1〕。Miso多通过阴道或口服方式给药，但阴道放药不便且易增加感染机会，个别病例药物溶解不完全或阴道流血过多可能影响药物吸收;口服给药虽然依从性较好，但疗效平平，且部分患者会因呕吐而损失药量、影响效果，空腹时间过长也易引发低血糖反应。故近来国外一些学者开始探索舌下含服的方法，并初步显示了其可行性和优越性，为早孕药物流产开辟了更加简捷有效的新途径。 1Miso舌下含服的药理学基础及相关研究 舌下含服的药物吸收机制在各种给药途径中，舌下含服的药物吸收速度和生物利用度仅次于静脉注射和吸入。舌下黏膜渗透能力强，流经黏膜的血液经舌静脉、面静脉、后腭静脉和颈内静脉直接进入循环系统，避免了肝脏的首过效应，避开了胃肠道消化液的降解，且不受食物作用和胃排空状态的影响。 经不同给药途径的药代动力学研究Tang等〔2〕用气相层析同步质谱法测定了40例早孕妇女分别经舌下、口服、阴道、阴道加水的给药途径给予Miso400μg后的药代动力学指标。其体内活性代谢产物米索前列酸的血药浓度峰值（Cmax）分别为、、、;到达峰值的时间（Tmax）分别为、、、;舌下组的由曲线下面积AUC360决定的生物利用度显著高于另3组。Bygdeman等〔3〕也报道了口服Miso的Tmax约为30min，阴道组的Tmax为70～80min，舌下组的Tmax与口服组一样，但血药浓度下降的显著慢。由此可见，舌下、口服、阴道3种给药途径中，舌下含服的Cmax最高，药物吸收速度最快且最完全。 经不同给药途径的兴奋子宫肌作用研究Aronsson等〔4〕测定了舌下、口服、阴道给予Miso400μg后的子宫张力变化。宫内压开始增加的时间分别为、、，舌下组与口服组差异无显著性，但均显著快于阴道组。最大压值未明确指出，但除了给药后15min时舌下组的宫内压稍低于口服组外，其他同期均高于口服组和阴道组，且给药后75min、105min、135min时舌下组与口服组的差异有统计学意义。研究还发现，舌下组和阴道组均有规律宫缩，口服组却没有，其机制尚不清楚。可见，舌下组发挥兴奋子宫肌的作用比阴道组更快、比口服组更强。 2Miso舌下含服的研究现状 目前国内已有关于舌下Miso用于预防剖宫产术后出血〔5〕和足月妊娠引产〔6〕的研究，也有用于绝经后妇女取环的报道〔7〕。 Tang等〔8〕首次将舌下Miso用于药物流产，其中的中期妊娠部分，对18例平均孕15周者给予400μgMiso舌下含服，每3h1次，每天最多5次，24h内胎儿娩出率为，48h内胎儿娩出率为，另一名孕妇于娩出胎儿，初步证实了舌下Miso的可行性。Vimala等〔9〕对50例平均孕周的中期妊娠者给予800μgMiso单次舌下含服，24h内胎儿娩出率为82，48h内胎儿娩出率为92，表明大剂量单次给药与小剂量重复给药的药流效果相似，可见舌下Miso对终止中期妊娠也有较好的效果。 舌下Miso对早期妊娠药物流产的应用，仍处于起步阶段。国外近来才有相关研究，国内尚未发现这方面的报道。现有的研究虽初步显示了其可行性和优越性，但试验设计有待进一步完善，还有一些问题有待深入探索，现分析如下。 舌下含服用于早孕药物流产为了更加直观、有条理地描述现有的8个试验，将各试验的主要研究方法及评价指标列于表1。 表1现有的Miso舌下含服用于早孕药流的临床研究（略） 注:ˇ单用Miso;△口服200mg米非司酮36～48h后联合应用Miso;—未统计 Tang等〔8〕是第一个将Miso舌下含服用于早孕药流的临床研究，首次证实了Miso舌下含服的可行性。Tang等〔12〕是第一个比较舌下和阴道途径的随机对照试验。Wagaarachchi等〔13〕是第一个米非司酮联合舌下Miso用于早孕药流的研究。Tang等〔16〕则是第一个比较米非司酮联合舌下或阴道Miso的随机对照试验。 完全流产率此类研究最关注的就是完全流产率的问题，由于受试对象入选标准、孕龄及用药剂量的差异，在一定程度上降低了各研究间的可比性。但通过仔细分析，有以下发现:（1）受试对象为静止性流产者，可能影响药流效果。上述研究中的受试对象，有的为正常妊娠，有的则为无胚胎妊娠或无生机妊娠等静止性流产〔8，12，13〕。1985年由Berna-rd和Cooperberg提出的静止性流产的超声诊断标准为:①宫内妊娠囊平均直径≥2cm时仍无胎芽;②有胎芽，但无胎心搏动;③妊娠囊直径<2cm，无内容物生长而在随后的7～10天内持续缺乏胎心搏动。1998年Ashok等报道口服200mg米非司酮36～48h后阴道放置800μgMiso对孕9～13周的完全流产率为95，Child等〔17〕也报道此法对孕9周内的完全流产率达，但Wagaarachchi等〔18〕的研究中，用同样方法对孕6～13周无生机妊娠的完全流产率仅为，因此他们认为静止性流产的药流成功率偏低，可能与胚胎死亡后的低孕酮浓度有关。Wagaarachchi等〔13〕与另3个米非司酮联合舌下Miso的研究相比，完全流产率较低，可能就缘于受试对象为静止性流产者，但也不除外用药剂量较小或孕龄较大所致。Tang等〔8〕的完全流产率高于另3个单用舌下Miso的研究，似与该假说矛盾，但也可能与其样本数较小有关。故静止性流产是否会影响舌下Miso的药流效果，尚需对照试验证实。（2）孕龄越长，完全流产率可能越低。由于干扰因素较多，在各研究间进行比较有一定困难。可幸的是，Tang等〔10〕统计了孕龄<7周、7～9周、>9周的完全流产率分别为100、和，表明孕龄越长，完全流产率越低。米非司酮联合舌下Miso的4个研究也符合这一趋势。（3）是否用药剂量越大，完全流产率越高。现有研究的Miso用量为400μg、600μg或800μg不等，尚无同时比较各剂量效果的随机对照试验。Tang等〔10〕和Cheung等〔11〕分别对孕龄<7周的正常妊娠妇女给予舌下Miso600μg和400μg，完全流产率为100和86，表明600μg的疗效比400μg好。由于2个舌下含服800μgMiso的研究〔14，16〕均未单独统计孕龄<7周的完全流产率，尚无法比较800μg与600μg的疗效，有待进一步研究。 平均排囊时间平均排囊时间也是各研究的主要观察指标之一。总体上，米非司酮联合Miso比单用Miso的排囊时间短，仅Wagaarachchi等〔13〕稍长（），可能也与受试者为静止性流产、孕龄较长或用药剂量较小有关。Tang等〔12〕中，虽然舌下组的平均排囊时间（）明显短于阴道组（），却无统计学意义，可能与样本较小有关，尚需大样本的研究。Hamoda等〔15〕研究中舌下组的排囊时间显著短于阴道组，但由于该研究为非随机试验，舌下组的孕龄也显著短于阴道组，故缺乏说服力。而在设计较完善的Tang等〔16〕中，两组的平均排囊时间差异无显著性。 术后带血天数及血红蛋白含量变化现有5个研究统计了药流术后的平均带血天数，12～20天不等，尚未发现舌下组与阴道组有差别。6个研究〔8，10～12，14，16〕比较了给Miso前、术日、术后7天和43天的血红蛋白含量，差异均无显著性，表明患者的失血较少，对血液成分的影响较小。 副反应上述研究中，舌下组的主要副反应发生率为:腹痛89～100、腹泻40～72、恶心44～68、呕吐18～57、寒战30～82，发热（体温≥38℃）39～79。其数值变异较大可能由各研究中受试者孕龄及用药剂量等因素的差异所致。在与阴道给药的对照性研究中，舌下组呕吐、腹泻的发生率显著高〔12，15，16〕。Chong等〔19〕研究发现Miso的口服水溶液与口服片剂、直肠、阴道给药相比，开始发生缩宫反应的时间显著短，但寒战和发热的副反应也显著高。研究者将其推断为增加的副反应是由米索前列酸的高血药浓度所致，因其既作用于子宫受体，也可作用于其他部位的受体，故提出警示:当舌下含药能更好地吸收并引起更快更强子宫收缩的同时，也可能引起更大的副反应。这一假说恰被舌下组呕吐、腹泻的高发生率所验证，可能与其兴奋胃肠道平滑肌的作用更强有关。故需同时比较舌下含服不同剂量Miso的疗效和副反应，以确定疗效又好、副反应又小的最佳用药剂量。 依从性舌下组的完全流产者中，80～90认为腹痛可忍受，76～85认为阴道流血可接受，80～98如再次非意愿妊娠仍将选择舌下含药方法，88～90愿将此法推荐给他人。Hamoda等〔15〕进行的非随机试验中，虽然舌下组的副反应发生率高于阴道组，但更多患者选择舌下含服的方法且满意率也高于阴道组，因此研究者推断，患者宁可接受较多的副反应而尽量避免阴道给药。这些都充分说明了舌下含药的良好依从性。 但因尚无专供舌下含服的剂型，现有的研究均将口服片剂置于舌下。药片约经10～l5min溶化，为使药物尽量通过口腔粘膜吸收完全，嘱患者15min内不能吞咽〔8〕。有少数患者反映不喜欢含药时的口感，这也为我们提出了可发展的空间，即能否研制出体积较小、水果口味、易含化崩解的Miso舌下含服剂型。 尚无舌下Miso与口服Miso的对照性研究由现有资料可见，尚无舌下与口服的对照性研究，而口服给药恰是我国早孕药物流产的标准方法。许多文献都提及了EI-Refaey等〔20〕的研究，该试验结果显示了用于早孕药流的米非司酮联合阴道或口服Miso的完全流产率分别为95和87。Zieman等〔21〕的药代动力学试验也表明，虽然阴道组的血药峰值出现慢且较低，但可保持至给药后4h，使得由AUC360决定的生物利用度是口服组的3倍，正好解释了阴道比口服给药临床效果好的原因。Khan等〔22〕的药代动力学试验也得到相似结论，阴道组的AUC240几乎是口服组的3倍。由此推论，只要舌下比阴道给药的临床效果好或相似，就比口服效果好，因而研究者们更关注于比较舌下与阴道给药的效果。但这并不意味着没必要比较舌下与口服，基于科学研究的严谨性和全面性，仍需进行同时比较3者的临床研究。综上所述，Miso舌下含服用于早孕药流的研究已取得一定成果，初步显示了给药方便、效果良好、降低了阴道给药的感染机会、不受食物作用和胃排空状态影响的优势，对此法的进一步探索和完善，必将推动我国乃至全世界计划生育事业的发展。参考文献 1ChongYS，SuLL，∶aquartercenturyofuse，abuse，，2004，59（2）:128-140. 2TangOS，SchweerH，SeyberthHW，，2002，17（2）:332-336. ，2003，17（5）:707-716. 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