华东理工大学学位论文脂氧合酶

New Development on Research and Application of Microbial Epoxide HydrolasesTang Yanfa, Xu Jianhe, Ye Qin(The State Key Laboratory of Bireactor Engineering, Shanghai 200237)Abstract Enantiopure epoxides, as well as their corresponding vicinal diols, are highly valuable chiral synthons useful for the synthesis of various biologically active molecules. One of the presently emerging approaches is the use of the enantioselective hydrolysis of racemic epoxides using epoxide hydrolases (EHs). In this context, major characteristics, substrate specificities and enantioselectivities of epoxide hydrolases from various microbial sources, such as bacteria and fungi, are words Epoxide hydrolase, Chiral epoxide, Chiral vicinal diol, Biotransformation, Optical resolution摘要 手性环氧化物及邻二醇是一些生物活性物质不对称合成中的重要中间体。应用细菌和真菌产生的环氧化物水解酶不对称水解消旋环氧化物来制备这些物质已引起人们的高度重视。此文对此进行了综述，并对它们的对映选择性进行了评价。关键词 环氧化物水解酶 手性环氧化物 手性邻二醇 生物转化 光学拆分--------------------------------------------------------------------------------微生物环氧化物水解酶的研究与应用新进展唐燕发 许建和 叶勤(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 上海 200237) 手性环氧化物及其开环产物邻二醇能与各种亲核试剂反应，因而在手性化合物的合成过程中被广泛应用，是一种重要的有价值的中间体。近年来很多研究小组都对它们的生产方法进行了研究[1]，如烯烃的Katsuki-Sharpless不对称环氧化和不对称二羟基化；烯烃的Jacobsen不对称环氧化。另一方面很多利用生物催化合成这类物质的方法已有报道，如水解酶类(特别是脂肪酶和酯酶), a-卤酸脱卤素酶，乳酸脱氢酶或甘油脱氢酶，单加氧酶，过氧化物酶和卤过氧化物酶。以上各种方法有的对底物有特殊要求，有的对映选择性不高，有的需要氧化还原辅酶如NAD(P)H，这些都限制了它们的应用。不依赖于辅因子的环氧化物水解酶[]可以有效地代替以上各种方法，环氧化物水解酶最初是在哺乳动物肝组织的解毒功能研究中被发现，但由于从哺乳动物中得到的这种酶来源有限，故限制了其大规模应用，但近年来发现在一些微生物如细菌、真菌中也存在环氧化物水解酶，有效地解决了这一问题。本文将综述各类细菌和真菌产生的环氧化物水解酶。1 环氧化物水解酶作用机理 酶的一个天冬氨酸残基进攻被酶的一个赖氨酸残基部分质子化的环氧化物的一端形成一个共价结合的二元醇单酯-酶中间体[2,3]，酶的组氨酸残基[4]从落到酶活性中的一个水分子中夺取一质子从而产生一个羟基，这个羟基进攻二醇-单酯-酶中间体，水解产生二醇，如图1。 图1 环氧化物水解酶的作用机理图2 环氧化物微生物水解时构型保持和构型反转 水解时有两个不同的途径，如图2。 (1) 羟基进攻取代较少的碳原子，手性中心构型不变(如by Asper- gillus niger)[5]。 (2) 羟基进攻取代较多的碳原子(即手性中心)从而使手性中心构型反转(如by B. sulfurescens)[5]。 在两种途径中，进入的羟基都是以反式立体方式进入的，若环氧环的两碳原子都是手性碳，则羟基进攻的任何位置碳原子的构型都将反转。虽然保持构型不变的第一种方式较普遍，但也有一些构型反转的例子已报道[5-7]。2 细菌产生的环氧化物水解酶 早期美国Illinois大学等小组发现Pseudomonad sp. NRRL 2944[8]、Psedomonas pautida[9]、Bacillus megaterium ATCC 14581[10]中存在环氧化物水解酶，但真正开始对环氧化物水解酶的研究是由奥地利的K. Faber研究小组进行的。他们最初在用Rhodococcus sp. NOVO 409的固定化酶水解腈化合物的研究中发现该酶具有未知的能水解环氧化物的活性。对1,1-二取代环氧化物，当R1为甲基，R2为一长碳链时，对映选择性最高，剩余R-环氧化物和水解产物S-二醇ee值分别为72%和40%；对单取代环氧化物，ee值都很低；而内消旋环氧化物则不能作为底物[11]，如图3。 图3 Rhodococcus sp. NOVO 409不对称水解1,1-二取代环氧化物 之后他们[12]筛选了43种菌，其中7种显示活性，即4种细菌：Rhodococcus spp. NCIMB 11216, NCIMB11215 和NCIMB 11540及Corynebacterium sp. UPT 9；3种真菌：Diploida gossypina ATCC 10936, Fusarium solani DSM 62416 和Glomerella Cingulata ATCC 10534。其中第一和第四种细菌对2-环氧辛烷有中等活性，都优先水解R型环氧化物形成R-1,2-二羟基辛烷，但对映选择性很低。NCIMB11540水解2-甲基-1,2-环氧庚烷时产生的S-二醇和剩下的R-环氧化物ee值分别为89%和51%，E值为29。NCIMB 11216[13]水解2-甲基-1,2-环氧庚烷，2-甲基-1,2-环氧壬烷和2-甲基-1,2-环氧十一烷时，产物S-二醇ee值分别高达96%、98%和99%，剩下的R-环氧化物ee值亦分别为71%、25%和55%，E值分别为104、126和200，可见两个取代基差别愈大，选择性愈高，当把甲基改为乙基时，对映选择性E值急剧下降，其纯酶[14]表明该酶不需要辅酶，是一个溶解性的寡酶，分子量为35 kDa，等电点为。催化2-甲基-1,2-环氧庚烷时，最佳温度为30°C，最佳pH为，这个菌可运用于芳樟醇[15](一些植物和果实的香味物质)的合成中。 另有两种菌Rhodococcus equi IFO 3730和Mycobacterium paraffinicum NCIMB 10420[1]对1,1-二取代环氧化物也显示相似的对映选择性，E值大于200，其中第一个菌可应用于昆虫性信息激素(S)-(-)-Frantalin[16]的合成中，在拆分过程中E=39。 最近又发现另外4种菌，Nocardia sp. H8, Nocardia sp. EH1, Nocardia sp. TB1和Rhodococcus ruber DSM 43338[17]对2-甲基-1,2-环氧庚烷也具有很好的选择性(E>200)。以前的情况是若得到的二醇光学活性高，但转化率总是较低，使收率很低，并且剩下的环氧化物光学活性也很低，然而，两种新菌Nocardia sp. EH1和Nocardia sp. TB1对底物的转化率都达到50%，并且剩下的R-环氧化物和形成的S-二醇ee值都大于99%。在长侧链上引入一个芳香基团(即底物为4-苯基-2-甲基-1,2-环氧丁烷)则Nocardia菌对此底物的选择性急剧降低(EH1, E=12; TB1, E=13)。若酶水解后，再加酸处理，即两步反应在一起连续进行，则得到同一种构型的二醇[18,19]，收率都大于90%，ee值都大于99%。从Nocardia sp. EH1中提取的粗酶[20,21]水解顺式2,3-环氧庚烷，得到单一的产物(2R,3R)-2,3-二羟基庚烷，收率为79%，ee值为91%。两种异构体的水解都发生在分子中构型为S的碳原子上，故得到(2R,3R)-二醇这一种产物。此粗酶固定化[22]于DEAE-Cellulose后，酶的对映选择性只有很小的下降，但酶活提高了1倍多(为原来的225%)，最佳温度可从35°C提高到45°C，重复反应5次后，酶活仍有55%。纯化后得到的纯酶[23]表明该酶不需要辅酶,是一种寡酶，分子量为34kDa，最佳pH为8~9。 以上所研究的细菌酶都显示出相似的对映选择性，比如它们都优先水解S-2-甲基-1,2-环氧烷烃，Faber等还分离到了另外两种具有相反对映选择性的菌株，即Mycoplana rubra和"Rot" [24]，第二种菌在分类学上还没有确定。对1,1-二取代环氧化物都优先水解R型，但对映选择性都不高。 Faber所研究的环氧化物水解酶都属于组成型酶，它们对2-甲基-2-烷基环氧化物等具有分支的末端1,2-环氧化物具有很高的对映选择性，但对于无分支的末端1,2-环氧化物只有很低的对映选择性，并且不水解内消旋环氧化物，而南非Botes等[25]应用Chryseomonas luteola拆分1,2-环氧辛烷，剩余的S-环氧化物和形成的R-二醇ee值分别为98%和86%，这是到目前为止首次报道在细菌中存在的对末端1,2-环氧化物具有很高对映选择性的环氧化物水解酶。 1995年英国Carter 和Leak [26]分离到一株菌Corynebacterium sp. C12, 所产环氧化物水解酶为诱导型酶。Archer等[27]应用此菌拆分1-甲基-1,2-环己烯环氧化物，有很好的对映选择性，得到(1R,2S)环氧化物，(收率30%, ee>99%)和(1S,2S)-1-甲基-1,2-二羟基环己烷(收率42% , 89% ee)。若随后再用酸水解剩下的环氧化物，则两步串级反应就得到单一的(1S,2S)-二醇产物(收率80%, ee>95%)。这种诱导型酶的底物特异性范围较小，只对与诱导物相关的底物有相对较高的活性。分离得到的纯酶[28]表明该酶是一种聚合酶，其亚单位分子量为43140Da。 1989年荷兰Van den Wijingard等[29]从淡水沉淀物富集培养液中分离得到革兰氏阴性菌Pseudomonas sp. AD1，所产环氧化物水解酶也为诱导型酶。纯化[30,31]后表明该酶是一种寡酶，分子量是35kDa，该酶能水解表氯醇、表溴醇、环氧辛烷及苯乙烯环氧化物。基因克隆后在E. coli中表达[32]的重组酶水解苯乙烯环氧化物和对氯苯乙烯环氧化物[33]时对映选择性分别为和。Rink等[34]研究了其催化机理。除此之外，日本Nakamura等[35,36]发现在Corynebacterium sp. N-1074中存在两种环氧化物水解酶(IIa, IIb)也能降解表氯醇，其中酶IIb具有较高的对映选择性。 1999年荷兰Van Der Werf等报道[37]发现了一类新的产生于Rhodococcus erythropolis DCL 14的环氧化物水解酶。单萜能诱导该菌产酶，该酶是一种寡酶，分子量为17kDa，不需辅酶，在pH=7和50°C时酶活最高。只有柠檬烯-1,2-环氧化物，1-甲基-1,2-环己烯环氧化物，环己烯环氧化物和茚环氧化物可作为其底物。水解1-甲基-1,2-环己烯环氧化物时对映选择性同Corynebacterium sp. C12[27]相反，但两种情况下都得到(1S,2S)-二醇，说明该酶具有不同的催化机理。 从以上的综述可以看出，含有环氧化物水解酶的细菌比五六年前所认为的要普遍的多，这些细菌分别属于Pseudomonas, Rhodococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Mycoplana,“Rot”, Bacillus, Agrobacterium, Xanthobacter及Chryseomonas 等，其中Rhodococcus sp. NCIMB 11216, Nocardia sp. EH1 和Nocardia sp. TB1对2-甲基-2-烷基环氧化物等具有分支的末端1,2-环氧化物具有很高的对映选择性；Chryseomonas luteola对无分支的脂肪族末端1,2-环氧化物具有特别高的对映选择性。底物结构与酶的对映选择性的关系才刚被探讨，只有当底物具有严格的取代方式时，才具有高对映选择性。同单取代环氧化物相比，C-2位的甲基对对映选择性有重要的作用，然而，当甲基变为乙基后就丧失了对映选择性，这表明存在着一个相当严密的活性位点，只有一部分底物能符合它。大多数酶对被测试的底物显示相同程度的对映选择性，甚至对单取代和双取代环氧化物显示相似的对映选择性的变化，这些相似性表明这些酶在进化上是具有联系的。相信随着研究的深入，会有更多的有关这方面的研究报道。组成型酶对1,1-二取代环氧化物具有较高的对映选择性，但比活力都不高；而诱导型酶虽然比活力较高，但仅对有限的底物有活力。盼望在不久的将来可运用基因工程技术来解决这一问题。3 真菌产生的环氧化物水解酶 虽然早期日本Suzuki等[38]和美国Kolattukudy[39]等发现真菌Helminthosporum sativum和Fusariun solani pis中存在环氧化物水解酶，但真正集中研究真菌环氧化物水解酶是由法国Furstoss等首先进行的。他们发现Aspergillus niger LCP 521能不对称水解香叶醇衍生物，制备Bower's compound[40](一种保幼激素类似物)；还可以选择性地水解非对映的8,9-环氧柠檬烯立体异构体，制备Bisabolol的4种天然立体异构体[41]。 1993年Furstoss等[5]报道了Aspergillus niger水解苯乙烯环氧化物剩下S-苯乙烯环氧化物(收率23%, 96% ee)，另一种菌Beauveria sulfurescens水解苯乙烯环氧化物具有良好的互补对映选择性，给出R-苯乙烯环氧化物(收率19%, 98% ee)，两种菌都产生同样的R-二醇，[18O]标记实验[42]结果表明A. niger水解发生于C-2，构型不变，而B. sulfurescens水解发生于C-1，构型反转。若在一个反应器中，同时用这两种菌水解苯乙烯环氧化物消旋物，则得到单一的二醇产物R-1-苯基-1,2-二羟基乙烷，收率92%，ee值为89%。在水解一系列取代苯乙烯环氧化物[43](底物结构如图4)时若苄位引入一个甲基如2就降低了A. niger的对映选择性，剩余S-环氧化物和R-二醇ee值分别为73%和32%；若在b位有取代如3-7，则都不能作为酶的底物。 图4 与A. niger 和 B. sulfurescens 反应的底物 B. sulfurescens水解a -甲基苯乙烯环氧化物2时对映选择性不高；水解顺式-b -甲基苯乙烯环氧化物3形成的(1R,2R)-二醇在所有转化率下几乎都光学纯，而剩下的(1R,2S)-环氧化物在所有转化率下ee值都很低(20%)；b ,b -二甲基苯乙烯环氧化物5不能作为B. sulfurescens的底物；水解茚环氧化物6和1,2-环氧四氢奈7后剩余的(1R,2S)- 环氧化物光学纯度很高(ee>98%)；水解反式-b -甲基苯乙烯环氧化物4产生的(1R,2R)-环氧化物和(1R,2S)-二醇收率(分别为30%和38%)和ee值(分别为98%和90%)都很好，它是唯一在转化率接近50%时，剩余的环氧化物和二醇产物光学纯度都很高的底物，但反式-环氧化物的对映选择性水解在文献中少有报道。 对一系列对位取代苯乙烯环氧化物[44]，A. niger都仍优先水解R-环氧化物形成R-二醇，剩余S-环氧化物ee值都大于96%，收率28%~38%。水解对硝基苯乙烯环氧化物时，若随后进行酸水解[45]，则得到单一的R-二醇(收率94%, 80% ee)，可用于制备b-肾上腺素阻断剂(R)-Nifenalol。酶水解时，若用粗酶[46,47]代替菌丝体，DMSO是抑制影响最小的一种助溶剂，反应后剩下的S-环氧化物ee值可达97%，转化率为47%，对映选择性也很高(E=41)，底物浓度可提高到330mmol/L()而不影响ee值，因此这个方法在制备规模的环氧化物拆分上很有用。B. sulfurescens仍显示互补的对映选择性，当取代基是-H, -CH3, -F, -Br时，水解剩余的R-环氧化物ee值都大于96%，除对硝基苯乙烯环氧化物外，水解所形成的二醇仍都具有R构型，给电子基团如p-CH3，使反应速度增加4倍，而吸电子基团不仅降低反应速率还降低对映选择性，这两种现象都显示有酸催化过程存在，并且在过渡态时有碳正离子存在。 另外，A. niger还可以对映选择性地水解对溴-α-甲基苯乙烯环氧化物[48]和缩水甘油环缩醛衍生物[49]。该酶已进行了优化生产[50]，纯化酶[51]表明该酶由4个相同亚基组成，每个亚基分子量为45kDa，40°C和pH=时酶活最高。 除此之外，韩国Choi[52]也筛选得到另一株A. niger；英国Grogan[53]也发现另一株真菌Beauveria densa CMC 3240，都可以不对称水解苯乙烯环氧化物。 1998年Furstoss等[54,55]用单取代、1,1-二取代、反式-1,2-二取代、顺式-1,2-二取代环氧化物作为底物对42种真菌进行筛选，得到7株有一定对映选择性的菌种，即A. niger LCP 521, A. terreus CBS 116-46, B. bassina ATCC 7159, C. globosum LCP 679, Cun. elegans LCP 1543,M. isabellina ATCC 42613, Syncephalastrum racemosum MUCL 28766。 对每一类底物几乎都可以用一二个菌水解得到光学纯的对映体，结果如表1。在用Syncephalastrum racemosum无细胞提取物[56]水解一系列对位取代苯乙烯环氧化物时，若对位是给电子基团如甲基有利于苄位(a位)进攻，若对位是吸电子基团如硝基则有利于β位进攻，决定反应速率的步骤是氧环的断裂，并且是第一次揭示出在反应过程中很可能存在着环氧化物的酸活化机理。表1 几种真菌对脂肪族环氧化物的不对称水解 底物 菌种 环氧化物收率/% ee/% 二醇收率/% ee/% 1,2-环氧辛烷 M. isabellina 18 97(S) 54 35(R) 2-甲基-1,2-环氧庚烷 A. niger 22 99(S) 62 32(R) 反式-1-甲基-1,2-环氧庚烷 C. globosum 12 97(1S,2S) 60 78(1R,2S) 反式-1-甲基-1,2-环氧庚烷 M. isabellina 11 98(1R,2R) 62 59(1R,2S) 顺式-1-甲基-1,2-环氧庚烷 C. globosum 8 97(1R,2S) 59 58(1R,2R) 1995年美国Merck研究人员[57]在80种真菌中筛选到2株能产生几乎光学纯(100% ee，但收率很低，只有14%)(1S,2R)-茚环氧化物(是HIV蛋白酶抑制剂MK639侧链的前体，是一个有价值的手性合成子)的真菌，即Diploida gossipina ATCC 16391和Lasiodiploa theobro- mae MF5215，另两种菌能产生光学纯度相当好(91% ee)的另一种对映异构体(1R,2S)-茚环氧化物，即Gilmaniella humicola MF 5363和Alentaria tenius MF 4352。第一种菌可用于制备规模的拆分。 图5 与Rhodotorula glutinis反应的底物 1997年荷兰Weijers等[58,59]发现Rhodotorula glutinis(一种酵母菌)可以水解一系列芳基取代、烷基取代和脂环族环氧化物，并具有较好的对映选择性，如图5。水解芳基取代环氧化物1, 4, 8，剩余环氧化物ee值大于98%，收率可高达48%；末端、中间、顺式和反式环氧化物水解得到的二醇ee值经常高达98%；可以高对映选择性水解内消旋环氧化物9和10，相应的二醇产物ee值分别可达98%和90%；(-)-柠檬烯环氧化物11的水解具有很高的非对映体选择性，剩余(1S, 2R,4S)-环氧化物，并产生(1R,2R,4S)-二醇产物(收率好，ee>98%)；对脂肪族末端1,2-环氧化物，当底物的链长具有6个以上碳原子时，酶活较高，对1,2-环氧庚烷和1,2-环氧己烷都可获得较高的对映选择性，对后者，剩余S-环氧化物和产物R-二醇ee值分别为98%和83%，收率分别为48%和47%，E值可达84，但此菌水解1,2-环氧辛烷时对映选择性相对较低，这促使作者以此化合物作为底物，对187株酵母菌进行了筛选[60]，虽然很多菌对此底物有活性，但具有一定对映选择性的菌很少，只有一些担子菌包括Trichosporon、Rhodotorula和Rhodosporidium具有较高的对映选择性，其中Rhodotorula araucariae CBS 6031和Rhodosporidium toruloides CBS 0349这两种菌既具有活性又具有较高的对映选择性(E值分别大于200和100)，水解时都是优先水解R-环氧化物，生成R-二醇，作者应用这两种菌进行了制备规模的拆分，把环氧化物的浓度提高500mmol/L，无明显不良影响，反应速率只分别下降了14%和16%。 除以上这些真菌外，Faber等筛选得到的3种真菌[12](见细菌部分)，Corynosporium cassiieda [61]和两种暗色真菌Ulocladium atrum CMC 3280及Zopfiella karachiensis CMC 3284[62]中也存在环氧化物水解酶，但对映选择性较低。 真菌环氧化物水解酶一般是组成型酶，可以用普通碳源大规模培养生产。它们具有相对较广的底物范围，对芳香族、取代脂环族和无分支的脂肪族末端1,2-环氧化物具有特别高的对映选择性。同细菌一样，含有环氧化物水解酶的真菌也比五六年前认为的多，这些真菌分别属于Helminthosporum, Fusarium, Aspergillus, Beauveria, Cunning- hamella, Syncephalastrum, Candida, Diploida, Lasiodiploida, Gilmaniella, Alentaria, Pleurotus, Rhodotorula, Trichosporon, Rhodosporidium, Glo-merella, Corynosporium，Ulocladium, Zopfiella, Saccharomyces等。4 结语 目前含有环氧化物水解酶的细菌和真菌的获得仍然是通过从已知菌种中筛选(组成型酶)[1,12,17,54,55,57,60]和从土壤中分离(诱导型酶)[26,29,37,52]。在一些真核生物生物异源物质特别是芳香族化合物的生物降解过程中和一些原核生物烯烃的生物利用过程中，环氧化物及其邻二醇都作为重要的中间体，这揭示出在这些生物中都存在着环氧化物水解酶，有利于对新菌种的发现。我室已从土壤中分离到一株Bacillus sp.，水解缩水甘油苯基醚时优先R-环氧化物产生R-二醇，并具有较高的对映选择性(E=)，这是到目前为在止对这个底物对映选择性最高的微生物。微生物环氧化物水解酶可通过微生物发酵培养大量获得，可以设想，在不久的将来具有较高对映选择性的微生物环氧化物水解酶必可应用于工业生产上，通过拆分价格较便宜的消旋环氧化物来制备光学纯的环氧化物及邻二醇

有些酶由一条多肽链组成，如溶菌酶等，有些酶虽然由几条多条肽链组成，但是肽链间通过二硫键共价连接（因此结合得很紧密），如胰凝乳蛋白酶由3条肽链组成，肽链间通过5对二硫键连接成一个整体，这些酶都称为 单体酶 （Monomeric Enzyme）

有些酶由两个或两个以上的亚基组成，亚基之间依靠次级键（氢键以及弱的共价键和范德华力）组成，亚基间的结合不很紧密。亚基可以是相同的，也可以是不同的，如己糖激酶由4个相同亚基组成，而琥珀酸脱氢酶由1个α亚基、1个β亚基组成，这样的酶称作 寡聚酶 （Oligomeric Enzyme）。

有的时候若干种酶依靠非共价键结合在一起，依次催化一些列相关反应，酶学委员会建议将这样一组酶称为 多酶复合物 （Multienzyme Complex）或者多酶体系（Multienzyme System）。如催化脂肪酸合成的7种酶和1种非酶载体蛋白共同组成脂肪酸合成酶系。

值得注意的是，多酶复合物中的每一种酶都有一个系统编号，而多功能酶则是同一种酶具有对应于不同催化活性的多个系统编号。

完全由蛋白质组成的酶称为 单纯酶 （Simple Enzyme），如脂肪酶、胰蛋白酶等。除蛋白外，还结合有一些对热稳定的非蛋白质小分子或金属离子的称为 缀合酶 （Conjugated Enzyme），如细胞色素氧化酶等。

缀合酶的蛋白质部分称为 脱辅酶 （Apoenzyme），非蛋白质部分称为 辅因子 （Cofactor），脱辅酶与辅因子结合形成的完整复合物成为全酶（Holoenzyme）。根据辅因子的性质及其与脱辅酶结合的紧密程度，将辅因子分为 辅酶 （Coenzyme）、 辅基 （Prosthetic Group）和 金属离子 。脱辅酶与辅酶可以通过透析分离，脱辅酶与辅基之间则不行。金属离子往往在催化反应中发挥重要作用。

在化学反应中，脱辅酶部分决定酶催化的专一性和高效性，辅因子则负责传递电子、原子或化学基团。

[1] 袁勤生. 酶与酶工程[M]. 第2版. 上海: 华东理工大学出版社, 2012.

华东理工大学管理科学与工程硕士专业介绍

管理科学与工程一级学科始建于xx年。现有导师18名，师资主要来自管理科学与工程系、电子商务研究所、现代运营管理研究所和金融工程研究所，另外还长期聘请著名专家学者和企业家参加科研与教学工作。该学科以普遍适用的综合性管理理论、技术、方法及其应用为研究与教学内容，现设有知识管理与信息系统、科技管理与技术创新、物流与供应链管理、管理系统工程、金融工程、项目管理等较广泛的学科研究方向。本学科导师先后承接了20余项国家自然科学基金、省部级自然科学基金和哲学社会科学基金等纵向课题，以及大量的地方政府和企事业单位委托项目等研究课题。所在的商学院建有大型的计算机实验中心，系所配有专用的小型实验室。

一、培养目标

本学科培养各类组织的高层次综合型管理人才。通过系统的理论教学、实践的亲身参与、具体的课题研究，使硕士研究生牢固掌握管理科学与工程的基本理论知识，熟练掌握管理方法和技术，具备独立探索和协作研究管理问题的能力，至少熟练掌握一门外语；具备良好的思维、表达、写作和组织能力；能从事开拓创性、高层次的管理工作。学位获得者面向政府机关、大中型企业、高等院校与科研院所等单位，也可继续攻读相关专业的博士学位。

二、学制和学习年限

硕士生的学制为年，学习年限不超过5年，课程学习学分有效期自研究生入学开始为5年。

三、研究方向

1．知识管理与信息系统

2．技术系统与科技管理

3．物流与供应链管理

4．管理系统工程

5．金融工程

6．项目管理

四、培养计划

研究生应在入学后一个月内，在导师组及导师的指导下制定培养计划，包括课程学习和学位论文工作计划。学位论文工作包括研究方向，已有工作基础，研究计划和时间安排等。

五、课程设置

1．总学分

本学科硕士生应完成不少于38学分的课程学习，一般在入学后的4个学习单元内完成。

其中，公共学位必修课程学分≥8学分，一级学科学位必修课≥14学分，二级学科（研究方向）学位必修课≥6学分，专业外语和外文文献原版著作阅读学位必修课1学分，专业选修课（非学位课）≥5学分；学术讲座课（非学位课程），必修2学分。

提倡硕士生自主学习和研究型学习，提高创新能力。鼓励硕士生在进行课程学习的同时，参与课题组的科学研究与学术活动，开展学位论文的前期工作。

在本科阶段未选修过“管理学原理”和/或“运筹学”课程且入学考试也未选考的学生要求补修并得到合格成绩，未选修过“微观经济学”课程的学生要求补修该课程并获得合格成绩，补修课程所得学分不计入总学分。

3．课程设置表

详见“华东理工大学管理科学与工程一级学科硕士研究生课程设置表” 。

4．鼓励交叉学科选课

根据资源共享的原则，鼓励研究生选修其他高校具有优势、符合我校培养要求的课程，经导师和学院核准后，学校承认校外学分。鼓励研究生选修其他学科的`课程作为本学科的专业选修课程。

5．选课及考试要求

课程设置表中设置的课程有一定的选修空间，研究生一旦选定某门课程，则必须参加该课程的学习和考试。考试不及格或无故缺考者，在学习年限内可有一次重考机会，重考与它届研究生同卷同堂进行，不再另行安排补考。参加重考的必须在新学期重新选课（重考前一个月到研究生院办理重考手续），取得考试资格。学位课重考仍未通过或学习年限内仍然不参加考试的，予以退学。

六、中期检查

1．硕士生中期检查在第4学期初进行，由学生所在学院负责。

2．中期检查的内容包括课程学习的学分和成绩、思想表现和参加学术活动情况。

七、论文发表

至少发表一篇由导师组指定的核心期刊学术论文。目前指定的核心期刊范围是：国家自然科学基金委认定的核心期刊、CSSCI认定的管理类核心期刊、学院2008年认定的一、二、三类期刊。中文论文要求字数在4000字以上，有摘要和参考文献。

八、学位论文

学位论文是硕士生基础理论知识和科学研究能力的具体体现，是硕士生培养质量的重要标志。

1．基本要求

(1)硕士生应首先在导师的指导下做好选题工作，选题应在本学科或交叉学科范围内，选择在社会发展和经济建设中的科学研究问题，或在学术上有一定理论价值的课题。

(2)从事学位论文研究的时间不少于一年。

(3)学位论文必须在导师的指导下由硕士生独立完成。

(4)学位论文要求选题新颖、概念清楚、立论有据、分析严谨、数据可靠、言简意赅、图表清晰、层次分明、格式规范，能体现硕士生坚实的理论基础、较强的独立工作能力和优良的学风。

(5)结合专业特点，参考文献要求在50篇以上，其中外文参考文献至少25篇。

(6)论文工作初期作开题报告；论文进行过程中，硕士生应至少向导师组作一次论文中期进展汇报，接受导师组对论文工作的阶段性检查，其中学位论文正文字数要求参照《华东理工大学学位授予工作细则》的有关规定。

(7)学位论文撰写格式应参照《华东理工大学研究生学位论文撰写格式的统一要求》。

2．开题报告

硕士生应首先搜集有关文献资料并进行实际调查，把握学科发展前沿，重视文献知识产权，写好文献综述，在此基础上，写出开题报告，并在硕士点导师组统一安排的开题报告会上作公开报告、答辩（开题答辩时间在第三学期末或第四学期初进行），经审核通过者方可进入学位论文工作。

3．论文内容

(1) 综述课题的理论意义和实用价值，国内外研究动态，需要解决的问题和途径以及本人做出的贡献。

(2) 对所得结果进行概括和总结，并提出进一步研究的看法和建议。

(3) 列出必要的原始材料以及所引用的文献资料。

(4) 引用别人的科研成果必须明确指出，与别人合作的部分应说明本人的具体工作。

4．论文内容知识产权

研究生从事毕业论文的工作内容、所取得成果的知识产权属华东理工大学。与外单位联合培养研究生或联合开展毕业论文的，根据合作合同判定知识产权归属。

九、学位授予

凡通过课程学习、完成学位论文，经导师及导师组审核，认为论文已达到硕士学位论文要求，可以组织论文评阅、答辩。

学位论文的评阅、答辩和学位申请与授予等工作按《中华人民共和国学位条例暂行实施办法》和《华东理工大学学位授予工作细则》的规定进行。

硕士学位论文答辩委员会由本学科、专业和相关学科、专业的教授、副教授或相当职称的专家至少三人组成，答辩委员会主席由教授或相当职称的专家担任。指导教师或学位论文评阅人参加答辩委员会，则学位论文答辩委员会至少应由五人组成。

通过学位论文答辩的研究生名单及材料将提请校学位评定委员会审查，讨论通过后，学生将被授予管理学硕士学位。

华东理工大学学位授予工作细则

(四)学位论文应在导师指导下由博士研究生本人独立完成，学位论文必须是一篇(或由一组论文组成的)系统的、完整的学术论文，学位论文正文不少于6万字，学位论文中文摘要1000字左右，英文摘要应是中文摘要的译本。

博士学位论文的撰写格式按照《华东理工大学关于研究生学位论文格式的统一要求》执行。

学位论文涉及国家机密和因知识产权保护需要保密的，应当保密。学位论文申请保密需经校保密委员会审定，办理有关手续。

第十八条 博士学位论文预审、评阅、答辩

(一)博士学位论文预审。博士研究生在通过全部课程学习且成绩合格，学位论文基本完成，申请博士学位论文评阅和答辩前，导师负责对学位论文的学术性、真实性和撰写的规范性进行预审。预审未通过，不能申请学位论文评阅和答辩。

(二)博士学位论文评阅。评阅人5～7名。评阅人应是本学科、专业或相关学科、专业的教授或相当职称的专家，其中至少二分之一为博士生导师，至少三分之二为外单位专家。如三分之一或以上评阅人的意见是属否定的，应暂缓答辩，并增加三名评阅人，如三分之二或以上评阅人的意见是属否定的，则此次申请无效。申请人的导师不能聘为学位论文评阅人。

评阅人的姓名不得告知学位申请人，评阅意见应密封传递。

(三)博士学位论文答辩。学位论文答辩委员会应由本学科、专业和相关学科、专业的教授或相当职称的专家至少五人组成，申请人的导师如果参加答辩委员会，则答辩委员会至少应由七人组成。委员中至少二分之一为博士生导师，至少二位为外单位专家。答辩委员会主席应由博士生导师担任(一般为外单位专家)。

答辩委员会在作出是否通过论文答辩和建议授予博士学位决议时，应采取无记名投票方式，经全体委员至少三分之二同意，方得通过。决议经答辩委员会主席和委员签字后，报学位评定分委员会审批。

博士学位论文在答辩中被认为不合格的，经论文答辩委员会全体委员半数以上同意，可做出在二年内修改论文并重新申请论文答辩一次的决议，答辩仍未通过或逾期未申请答辩者，本次申请无效。

答辩委员会认为申请人的论文虽未达到博士学位论文的学术水平，但已达到了硕士学位论文的学术水平，且申请人未曾获得过该学科硕士学位的，可作出建议授予硕士学位的决议。

属于军工保密的学位论文的评阅、答辩按军工保密条例规定执行，具体手续到军工办公室办理。

博士学位论文答辩一般应公开举行。

(四)学位论文的评阅与答辩专家。由博士研究生指导小组推荐或从学院专家库选择，并由学位评定分委员会主任审核。

(五)学位论文答辩秘书。由博士生导师指定论文答辩秘书一人，负责学位论文的预审、评阅和答辩的事务性工作。

第十九条 博士学位申请

在完成博士研究生培养方案所规定的课程学习，课程考试成绩合格并通过博士学位论文答辩，所取得的学术成果符合学校规定，可向所属学位评定分委员会提出博士学位申请。

申请时呈交：

(一)华东理工大学学位申请审批书;

(二)华东理工大学博士学位论文评阅书;

(三)华东理工大学博士学位论文评阅情况汇总表;

(四)博士学位论文5本;

(五)攻读博士学位期间发表的与博士学位论文有关的学术论文或SCI收录的国外期刊和CSSCI收录期刊出具的录用函的学术论文全文、出版的著作、科研成果鉴定书、获奖证书和专利复印件各1份。

第二十条 学位评定分委员会定期召开学位评定分委员会会议，审查申请博士学位人员材料，确定同意建议授予博士学位人员的名单，报送校学位评定委员会审定。

凡学位论文答辩委员会未同意建议授予博士学位者，学位评定分委员会不予审核。对答辩委员会同意建议授予博士学位者，经学位评定分委员会审核认为不合格的，可作出在二年内修改论文并重新答辩一次，或作出不同意授予博士学位的决议。

学位评定分委员会在作出是否同意建议授予博士学位的决议时，应以不记名投票方式表决，出席会议委员应不少于学位评定分委员会全体委员总数的三分之二。经出席会议的至少三分之二委员同意，且同意票数不少于学位评定分委员会全体委员总数的二分之一，方得通过。会议应有记录和同意建议授予博士学位的决议。在提交校学位评定委员会审核时，博士学位申请者应按“华东理工大学研究生学位论文匿名评审及申请学位学术成果要求的暂行规定”的要求，获得规定质和量的学术成果。校学位评定委员会对申请博士学位人员的材料逐个审核，在作出是否同意授予博士学位的决议时，应以不记名投票方式表决，经出席会议的至少三分之二委员同意，且同意票数不少于校学位评定委员会全体委员总数的二分之一，方得通过。

决定授予博士学位的名单报送国务院学位委员会备案。通过授予学位之日起三个月为公示期，公示期满无异议者颁发博士学位证书。

第五章 名誉博士

第二十一条 对于国内外卓越的学者或著名的社会活动家，经校学位评定委员会讨论通过，报国务院学位委员会批准，可授予名誉博士学位。

第六章 其他规定

第二十二条 同等学力人员申请学位具体要求详见《华东理工大学授予具有研究生毕业同等学力人员硕士、博士学位工作细则》

第二十三条 在我国学习的外国留学生和从事研究工作的外国学者申请学位，参照本细则办理。鉴于外国留学生的语言条件，来华留学研究生的论文可用中文或英语撰写和答辩。

第二十四条 校学位评定委员会对申请博(硕)士学位采取重点审议和一般审议相结合的审批办法。

一般审议：对学位申请人的情况做简单介绍。

重点审议：对学位申请人情况做详细介绍。

对出现下列情况之一者进行重点审议：

(一)学位评定分委员会讨论确认为优秀的学位论文，经学位委员会重点审议并通过的，其作者自然当选为荣誉毕业生;

(二)硕士学位论文评审结果有“异议”者;博士学位论文评审结果中出现 “D”或“未达到博士学位论文学术水平”或“暂缓答辩，作实质性修改再审”或”不建议答辩”的;

(三)学位申请人在学期间获得的学术成果不满足学校要求，但学位评定分委员会同意建议授予学位的;

(四)答辩委员会不记名投票表决，有反对票或弃权票的;

(五)学位评定分委员会不记名投票表决，有反对票或弃权票的;

(六)同等学力人员申请学位者;

(七)学位评定分委员会讨论决定重点审议的。

第二十五条 校学位委员会对各学位评定分委员会同意授予博(硕)士学位但按有关规定需重点审议的学位申请人员进行审核时，校学位评定委员会经充分评议，通过无记名投票表决方式最终做出是否授予学位的决定。如同意票数未达到要求的票数，则申请人本次学位申请无效。

校学位评定委员会作出不授予申请人学位的决议后，硕士学位申请人可在一年内且不超过学校规定的硕士研究生学习年限，通过学位评定分委员会向校学位评定委员会重新提出学位申请一次;博士学位申请人可在两年内且不超过学校规定的博士研究生和硕博连读研究生学习年限，通过学位评定分委员会向校学位评定委员会重新提出学位申请一次，逾期不再受理。

重新申请学位的程序：

(一)申请人在上述规定时间内继续研究、修改学位论文，按照有关规定重新参加学位论文查重、盲审。

(二)重新申请学位论文答辩。重新答辩时，答辩委员会需要重组。答辩通过后可向所在学位评定分委员会申请学位。

(三)学位评定分委员会审核，并对是否授予学位进行无记名投票表决，做出相应决议。

(四)校学位评定委员会审批。

第二十六条 学士、硕士和博士学位证书由学校颁发。硕士、博士学位证书生效日期为校学位评定委员会作出授予学位决定之日。

第二十七条 校学位评定委员会如确认学位错授或发现有舞弊作假等严重违反国家及学校有关规定的情况时，经复议，可撤销其学位。

第二十八条 建立学位论文档案。硕士和博士学位论文纸质本和论文摘要、论文全文的电子文档分送校档案馆、图书馆。同时，硕士和博士学位论文纸质本分送中国科学技术信息研究所、国家图书馆。

第二十九条 本细则未尽事宜，由华东理工大学学位评定委员会讨论决定。本细则的解释权归华东理工大学学位评定委员会。

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微生物环氧化物水解酶的研究与应用新进展 唐燕发 许建和 叶勤 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 上海 200237) 手性环氧化物及其开环产物邻二醇能与各种亲核试剂反应，因而在手性化合物的合成过程中被广泛应用，是一种重要的有价值的中间体。近年来很多研究小组都对它们的生产方法进行了研究[1]，如烯烃的Katsuki-Sharpless不对称环氧化和不对称二羟基化；烯烃的Jacobsen不对称环氧化。另一方面很多利用生物催化合成这类物质的方法已有报道，如水解酶类(特别是脂肪酶和酯酶), a-卤酸脱卤素酶，乳酸脱氢酶或甘油脱氢酶，单加氧酶，过氧化物酶和卤过氧化物酶。以上各种方法有的对底物有特殊要求，有的对映选择性不高，有的需要氧化还原辅酶如NAD(P)H，这些都限制了它们的应用。不依赖于辅因子的环氧化物水解酶[]可以有效地代替以上各种方法，环氧化物水解酶最初是在哺乳动物肝组织的解毒功能研究中被发现，但由于从哺乳动物中得到的这种酶来源有限，故限制了其大规模应用，但近年来发现在一些微生物如细菌、真菌中也存在环氧化物水解酶，有效地解决了这一问题。本文将综述各类细菌和真菌产生的环氧化物水解酶。 1 环氧化物水解酶作用机理 酶的一个天冬氨酸残基进攻被酶的一个赖氨酸残基部分质子化的环氧化物的一端形成一个共价结合的二元醇单酯-酶中间体[2,3]，酶的组氨酸残基[4]从落到酶活性中的一个水分子中夺取一质子从而产生一个羟基，这个羟基进攻二醇-单酯-酶中间体，水解产生二醇，如图1。 图1 环氧化物水解酶的作用机理 图2 环氧化物微生物水解时构型保持和构型反转 水解时有两个不同的途径，如图2。 (1) 羟基进攻取代较少的碳原子，手性中心构型不变(如by Asper- gillus niger)[5]。 (2) 羟基进攻取代较多的碳原子(即手性中心)从而使手性中心构型反转(如by B. sulfurescens)[5]。 在两种途径中，进入的羟基都是以反式立体方式进入的，若环氧环的两碳原子都是手性碳，则羟基进攻的任何位置碳原子的构型都将反转。虽然保持构型不变的第一种方式较普遍，但也有一些构型反转的例子已报道[5-7]。 2 细菌产生的环氧化物水解酶 早期美国Illinois大学等小组发现Pseudomonad sp. NRRL 2944[8]、Psedomonas pautida[9]、Bacillus megaterium ATCC 14581[10]中存在环氧化物水解酶，但真正开始对环氧化物水解酶的研究是由奥地利的K. Faber研究小组进行的。他们最初在用Rhodococcus sp. NOVO 409的固定化酶水解腈化合物的研究中发现该酶具有未知的能水解环氧化物的活性。对1,1-二取代环氧化物，当R1为甲基，R2为一长碳链时，对映选择性最高，剩余R-环氧化物和水解产物S-二醇ee值分别为72%和40%；对单取代环氧化物，ee值都很低；而内消旋环氧化物则不能作为底物[11]，如图3。 图3 Rhodococcus sp. NOVO 409不对称水解1,1-二取代环氧化物 之后他们[12]筛选了43种菌，其中7种显示活性，即4种细菌：Rhodococcus spp. NCIMB 11216, NCIMB11215 和NCIMB 11540及Corynebacterium sp. UPT 9；3种真菌：Diploida gossypina ATCC 10936, Fusarium solani DSM 62416 和Glomerella Cingulata ATCC 10534。其中第一和第四种细菌对2-环氧辛烷有中等活性，都优先水解R型环氧化物形成R-1,2-二羟基辛烷，但对映选择性很低。NCIMB11540水解2-甲基-1,2-环氧庚烷时产生的S-二醇和剩下的R-环氧化物ee值分别为89%和51%，E值为29。NCIMB 11216[13]水解2-甲基-1,2-环氧庚烷，2-甲基-1,2-环氧壬烷和2-甲基-1,2-环氧十一烷时，产物S-二醇ee值分别高达96%、98%和99%，剩下的R-环氧化物ee值亦分别为71%、25%和55%，E值分别为104、126和200，可见两个取代基差别愈大，选择性愈高，当把甲基改为乙基时，对映选择性E值急剧下降，其纯酶[14]表明该酶不需要辅酶，是一个溶解性的寡酶，分子量为35 kDa，等电点为。催化2-甲基-1,2-环氧庚烷时，最佳温度为30°C，最佳pH为，这个菌可运用于芳樟醇[15](一些植物和果实的香味物质)的合成中。 另有两种菌Rhodococcus equi IFO 3730和Mycobacterium paraffinicum NCIMB 10420[1]对1,1-二取代环氧化物也显示相似的对映选择性，E值大于200，其中第一个菌可应用于昆虫性信息激素(S)-(-)-Frantalin[16]的合成中，在拆分过程中E=39。 最近又发现另外4种菌，Nocardia sp. H8, Nocardia sp. EH1, Nocardia sp. TB1和Rhodococcus ruber DSM 43338[17]对2-甲基-1,2-环氧庚烷也具有很好的选择性(E>200)。以前的情况是若得到的二醇光学活性高，但转化率总是较低，使收率很低，并且剩下的环氧化物光学活性也很低，然而，两种新菌Nocardia sp. EH1和Nocardia sp. TB1对底物的转化率都达到50%，并且剩下的R-环氧化物和形成的S-二醇ee值都大于99%。在长侧链上引入一个芳香基团(即底物为4-苯基-2-甲基-1,2-环氧丁烷)则Nocardia菌对此底物的选择性急剧降低(EH1, E=12; TB1, E=13)。若酶水解后，再加酸处理，即两步反应在一起连续进行，则得到同一种构型的二醇[18,19]，收率都大于90%，ee值都大于99%。从Nocardia sp. EH1中提取的粗酶[20,21]水解顺式2,3-环氧庚烷，得到单一的产物(2R,3R)-2,3-二羟基庚烷，收率为79%，ee值为91%。两种异构体的水解都发生在分子中构型为S的碳原子上，故得到(2R,3R)-二醇这一种产物。此粗酶固定化[22]于DEAE-Cellulose后，酶的对映选择性只有很小的下降，但酶活提高了1倍多(为原来的225%)，最佳温度可从35°C提高到45°C，重复反应5次后，酶活仍有55%。纯化后得到的纯酶[23]表明该酶不需要辅酶,是一种寡酶，分子量为34kDa，最佳pH为8~9。 以上所研究的细菌酶都显示出相似的对映选择性，比如它们都优先水解S-2-甲基-1,2-环氧烷烃，Faber等还分离到了另外两种具有相反对映选择性的菌株，即Mycoplana rubra和"Rot" [24]，第二种菌在分类学上还没有确定。对1,1-二取代环氧化物都优先水解R型，但对映选择性都不高。 Faber所研究的环氧化物水解酶都属于组成型酶，它们对2-甲基-2-烷基环氧化物等具有分支的末端1,2-环氧化物具有很高的对映选择性，但对于无分支的末端1,2-环氧化物只有很低的对映选择性，并且不水解内消旋环氧化物，而南非Botes等[25]应用Chryseomonas luteola拆分1,2-环氧辛烷，剩余的S-环氧化物和形成的R-二醇ee值分别为98%和86%，这是到目前为止首次报道在细菌中存在的对末端1,2-环氧化物具有很高对映选择性的环氧化物水解酶。 1995年英国Carter 和Leak [26]分离到一株菌Corynebacterium sp. C12, 所产环氧化物水解酶为诱导型酶。Archer等[27]应用此菌拆分1-甲基-1,2-环己烯环氧化物，有很好的对映选择性，得到(1R,2S)环氧化物，(收率30%, ee>99%)和(1S,2S)-1-甲基-1,2-二羟基环己烷(收率42% , 89% ee)。若随后再用酸水解剩下的环氧化物，则两步串级反应就得到单一的(1S,2S)-二醇产物(收率80%, ee>95%)。这种诱导型酶的底物特异性范围较小，只对与诱导物相关的底物有相对较高的活性。分离得到的纯酶[28]表明该酶是一种聚合酶，其亚单位分子量为43140Da。 1989年荷兰Van den Wijingard等[29]从淡水沉淀物富集培养液中分离得到革兰氏阴性菌Pseudomonas sp. AD1，所产环氧化物水解酶也为诱导型酶。纯化[30,31]后表明该酶是一种寡酶，分子量是35kDa，该酶能水解表氯醇、表溴醇、环氧辛烷及苯乙烯环氧化物。基因克隆后在E. coli中表达[32]的重组酶水解苯乙烯环氧化物和对氯苯乙烯环氧化物[33]时对映选择性分别为和。Rink等[34]研究了其催化机理。除此之外，日本Nakamura等[35,36]发现在Corynebacterium sp. N-1074中存在两种环氧化物水解酶(IIa, IIb)也能降解表氯醇，其中酶IIb具有较高的对映选择性。 1999年荷兰Van Der Werf等报道[37]发现了一类新的产生于Rhodococcus erythropolis DCL 14的环氧化物水解酶。单萜能诱导该菌产酶，该酶是一种寡酶，分子量为17kDa，不需辅酶，在pH=7和50°C时酶活最高。只有柠檬烯-1,2-环氧化物，1-甲基-1,2-环己烯环氧化物，环己烯环氧化物和茚环氧化物可作为其底物。水解1-甲基-1,2-环己烯环氧化物时对映选择性同Corynebacterium sp. C12[27]相反，但两种情况下都得到(1S,2S)-二醇，说明该酶具有不同的催化机理。 从以上的综述可以看出，含有环氧化物水解酶的细菌比五六年前所认为的要普遍的多，这些细菌分别属于Pseudomonas, Rhodococcus, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Mycoplana,“Rot”, Bacillus, Agrobacterium, Xanthobacter及Chryseomonas 等，其中Rhodococcus sp. NCIMB 11216, Nocardia sp. EH1 和Nocardia sp. TB1对2-甲基-2-烷基环氧化物等具有分支的末端1,2-环氧化物具有很高的对映选择性；Chryseomonas luteola对无分支的脂肪族末端1,2-环氧化物具有特别高的对映选择性。底物结构与酶的对映选择性的关系才刚被探讨，只有当底物具有严格的取代方式时，才具有高对映选择性。同单取代环氧化物相比，C-2位的甲基对对映选择性有重要的作用，然而，当甲基变为乙基后就丧失了对映选择性，这表明存在着一个相当严密的活性位点，只有一部分底物能符合它。大多数酶对被测试的底物显示相同程度的对映选择性，甚至对单取代和双取代环氧化物显示相似的对映选择性的变化，这些相似性表明这些酶在进化上是具有联系的。相信随着研究的深入，会有更多的有关这方面的研究报道。组成型酶对1,1-二取代环氧化物具有较高的对映选择性，但比活力都不高；而诱导型酶虽然比活力较高，但仅对有限的底物有活力。盼望在不久的将来可运用基因工程技术来解决这一问题。 3 真菌产生的环氧化物水解酶 虽然早期日本Suzuki等[38]和美国Kolattukudy[39]等发现真菌Helminthosporum sativum和Fusariun solani pis中存在环氧化物水解酶，但真正集中研究真菌环氧化物水解酶是由法国Furstoss等首先进行的。他们发现Aspergillus niger LCP 521能不对称水解香叶醇衍生物，制备Bower's compound[40](一种保幼激素类似物)；还可以选择性地水解非对映的8,9-环氧柠檬烯立体异构体，制备Bisabolol的4种天然立体异构体[41]。 1993年Furstoss等[5]报道了Aspergillus niger水解苯乙烯环氧化物剩下S-苯乙烯环氧化物(收率23%, 96% ee)，另一种菌Beauveria sulfurescens水解苯乙烯环氧化物具有良好的互补对映选择性，给出R-苯乙烯环氧化物(收率19%, 98% ee)，两种菌都产生同样的R-二醇，[18O]标记实验[42]结果表明A. niger水解发生于C-2，构型不变，而B. sulfurescens水解发生于C-1，构型反转。若在一个反应器中，同时用这两种菌水解苯乙烯环氧化物消旋物，则得到单一的二醇产物R-1-苯基-1,2-二羟基乙烷，收率92%，ee值为89%。在水解一系列取代苯乙烯环氧化物[43](底物结构如图4)时若苄位引入一个甲基如2就降低了A. niger的对映选择性，剩余S-环氧化物和R-二醇ee值分别为73%和32%；若在b位有取代如3-7，则都不能作为酶的底物。 图4 与A. niger 和 B. sulfurescens 反应的底物 B. sulfurescens水解a -甲基苯乙烯环氧化物2时对映选择性不高；水解顺式-b -甲基苯乙烯环氧化物3形成的(1R,2R)-二醇在所有转化率下几乎都光学纯，而剩下的(1R,2S)-环氧化物在所有转化率下ee值都很低(20%)；b ,b -二甲基苯乙烯环氧化物5不能作为B. sulfurescens的底物；水解茚环氧化物6和1,2-环氧四氢奈7后剩余的(1R,2S)- 环氧化物光学纯度很高(ee>98%)；水解反式-b -甲基苯乙烯环氧化物4产生的(1R,2R)-环氧化物和(1R,2S)-二醇收率(分别为30%和38%)和ee值(分别为98%和90%)都很好，它是唯一在转化率接近50%时，剩余的环氧化物和二醇产物光学纯度都很高的底物，但反式-环氧化物的对映选择性水解在文献中少有报道。 对一系列对位取代苯乙烯环氧化物[44]，A. niger都仍优先水解R-环氧化物形成R-二醇，剩余S-环氧化物ee值都大于96%，收率28%~38%。水解对硝基苯乙烯环氧化物时，若随后进行酸水解[45]，则得到单一的R-二醇(收率94%, 80% ee)，可用于制备b-肾上腺素阻断剂(R)-Nifenalol。酶水解时，若用粗酶[46,47]代替菌丝体，DMSO是抑制影响最小的一种助溶剂，反应后剩下的S-环氧化物ee值可达97%，转化率为47%，对映选择性也很高(E=41)，底物浓度可提高到330mmol/L()而不影响ee值，因此这个方法在制备规模的环氧化物拆分上很有用。B. sulfurescens仍显示互补的对映选择性，当取代基是-H, -CH3, -F, -Br时，水解剩余的R-环氧化物ee值都大于96%，除对硝基苯乙烯环氧化物外，水解所形成的二醇仍都具有R构型，给电子基团如p-CH3，使反应速度增加4倍，而吸电子基团不仅降低反应速率还降低对映选择性，这两种现象都显示有酸催化过程存在，并且在过渡态时有碳正离子存在。