大脑性研究论文

谈补阳还五汤对脑缺血大鼠神经功能及细胞形态的影响论文

脑缺血属中风范畴，是临床常见病，具有高发病率、高死亡率及高致残率的特点，严重危害着人类健康。迄今为止，国内外在治疗脑缺血及其后遗症方面还缺少有效的化学治疗药物。循证医学表明，中医药对缺血性脑卒中的治疗有一定优势。当前大量研究集中在中药对急性脑缺血损伤的保护作用。而脑缺血后的功能恢复是一个较长时间过程，目前对其进行较长时间观察的研究较少。出自清代王清任《医林改错》的补阳还五汤，是治疗缺血性中风及中风后遗症的经典名方，该方在临床上应用广泛且疗效确切，但其促神经功能恢复机制还需进一步阐明。本文采用大脑中动脉线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型，探讨了补阳还五汤较长时间多时间点对其神经功能的.保护作用，以期为治疗缺血性脑中风临床用药提供实验依据。

1 材料

1. 1 动物健康雄性SD 大鼠189 只，SPF 级，体重260 ～ 280 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号SCXK( 湘) 2009-0004，动物合格证号004535。

1. 2 药物补阳还五汤处方来源于清·王清任《医林改错》，按原方组成: 黄芪120 g，赤芍4. 5 g，川芎3 g，归尾6 g，干地龙3 g，红花3 g，桃仁3 g，药材经湖南中医药研究院鉴定均符合《中国药典》2005 年版标准。补阳还五汤药剂制备: 饮片先用清水浸泡30 min，第一煎加药材及5 倍体积双蒸水，煎煮60min，二煎5 倍体积双蒸水，煎煮60 min，两煎混匀，浓缩至含生药2 g·mL - 1，冷藏待用。

1. 3 试剂10% 水合氯醛( 扬州市奥鑫助剂厂) ，多聚甲醛( 长沙市锦华化工有限公司) ，TTC( 红四氮唑，Sigma 公司) 。

1. 4 仪器Bx51 光学显微镜及IPP5. 1 图像分析系统( 日本Olympus) ，FA 型电子天平( 上海台之衡电子衡器有限公司) ，自动双重纯水蒸馏器( 上海玻璃仪器一厂) ，Finesse 325 型石蜡切片机( 英国Shando) 。

2 方法

2. 1 分组与给药将大鼠随机分为假手术组、模型组和补阳还五汤组，每组63 只，每组动物又分3 个时间点，即分别于首次给药后7， 14， 21 d 处死，每个时间点21 只动物。补阳还五汤组动物于术后2 h后开始给药，给药剂量为5 g·kg - 1·d - 1，每日ig 1次。模型组和假手术组动物均给予等体积蒸馏水。

2. 2 模型制备与评价参照文献采用大脑中动脉线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型: 10% 水合氯醛( 3. 5 mL·kg - 1 ) ip 麻醉，取颈正中切口长约3cm，逐层分离，结扎颈外动脉，夹闭颈内动脉、再结扎颈总动脉，于颈总动脉充盈分叉部下方约4 mm处将一长为4 cm 直径为0. 26 mm 的尼龙鱼线插入颈内动脉，直到遇到轻微阻力为止，固定尼龙线，缝合切口。假手术组仅切开皮肤、分离左侧颈总动脉后随即缝合。术后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒内，自由饮水、进食。动物清醒2 h 后参照Longa及Bederson的5 分制法进行神经功能评分，分值在1 ～ 3 分者入组。0 分: 无神经损伤症状; 1 分: 不能完全伸展对侧前爪; 2 分: 向对侧转圈; 3 分: 向对侧倾倒; 4 分: 不能自发行走，意识丧失。评分越高，神经功能缺损越严重，反之亦然。不纳入标准: 评分低于1 分; 蛛网膜下腔出血; HE 染色无脑缺血病理改变; 未到时间点死亡。死亡等不足动物时随机替补。

2. 3 指标检测

2. 3. 1 TTC 染色测脑梗死面积比每组每个时间点5 只大鼠， 10% 水合氯醛麻醉后，断头取大脑，置于- 20 ℃ 冷冻20 min 后，自额极每隔2 mm 切1片。第1 刀在脑前极与视交叉连线中点处; 第2 刀在视交叉部位; 第3 刀在漏斗柄部位; 第4 刀在漏斗柄与后叶尾极之间，共A，B，C，D，E 5 片。用2%的红四氮唑染色，37 ℃下避光30 min，正常组织呈深红色，而梗死组织则为白色。拍照后选最大缺血断面C 片梗死面积，运用Image-Pro Express 图像分析系统扫描计算，取梗死面积占C 片大脑总面积的百分比表示。为消除梗死侧大脑半球因脑水肿造成的误差，按Swanson 方法进行校正后计算C 片梗死面积百分比( IS) 。IS = ( S1 - Sr) /2S1 × 100%S1: C 片健侧总面积; Sr: C 片患侧非梗死区面积。

2. 3. 2 神经功能评分每组每个时间点10 只大鼠，于术后2 h 及动物处死前1 h 进行神经功能评分。

2. 3. 3 HE 染色观察海马、皮质组织病理学变化每组每个时间点6 只。同2. 3. 1 取大脑后4% 多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，脑冠状连续切片( 片厚5 μm) ，取含海马切片贴于载玻片上，随后HE 染色，光镜下观察比较各组大鼠左侧海马、皮质组织细胞形态病理学改变。

2. 4 统计学分析

所有数据以珋x ± s 表示，应用SPSS 19. 0 统计软件对数据进行统计分析，组间比较用单因素方差分析，P < 0. 05 被认为具有统计学意义。

3 结果

3. 1 各组脑梗死面积比较通过TTC 染色，假手术组着色比较均匀，为深红色; 7， 14， 21 d 模型组与补阳还五汤组染色不均匀，局部梗死区为白色，梗死部位在缺血侧顶叶大脑皮质、海马周围。梗死面积分析显示，模型组和补阳还五汤组随时间点后延脑梗死面积均逐渐缩小( P < 0. 05) ; 且7， 14， 21 d 补阳还五汤组梗死面积明显小于同时相模型组，差异具有统计学意义( P < 0. 05) 。

3. 2 各组神经功能评分情况假手术组各时间点大鼠神经功能评分均为0 分; 补阳还五汤组各时间点神经功能评分均较同时相模型组低，差异具有统计学意义( P < 0. 05) 。

3. 3 各组海马、皮质组织细胞形态学变化

3. 3. 1 海马假手术组海马细胞形态正常，细胞轮廓清晰可见，细胞核染色均匀，细胞排列整齐，间质着色均匀。7，14，21 d 模型组海马神经细胞皱缩，出现细胞核固缩，核边集严重，细胞内有空泡，细胞形态由椭圆形变成梭形、三角形，细胞间间距增大，间质染色稀疏，有空洞。7， 14， 21 d 补阳还五汤组海马细胞空泡样细胞较模型组明显减少，细胞形态明显改善，细胞排列较模型组整齐。7，14 d 补阳还五汤组仍存在少量核深染及空泡样改变细胞，但21 d 补阳还五汤组海马细胞形态接近假手术组。

3. 3. 2 皮质假手术组皮质细胞形态正常，边缘清晰，排列整齐，形态完整，胞核着色均匀，细胞间质染色均匀。7，14，21 d 模型组缺血细胞呈空泡样坏死，细胞形态丧失，细胞间间隙增大，染色变浅，呈网状改变; 残存细胞其体积缩小、细胞核固缩深染、细胞边界不清。补阳还五汤组各时间点皮质细胞空泡样细胞较同时间相模型组明显减少，细胞形态明显改善，细胞排列整齐，神经细胞核较清晰，细胞间隙染色较均匀。

4 讨论

局灶性脑缺血又称缺血性脑卒中，是由于脑的血液供应障碍，导致脑组织缺血、缺氧，所致相应区域脑梗死性坏死，大量神经元丧失，而产生相应的神经功能缺损症状与体征，是脑血管疾病中最为常见的临床类型。目前西医治疗脑缺血的主要方法包括溶栓、抗凝、降纤、扩血管、高压氧、介入治疗等，还有尚处于动物实验阶段的基因治疗、神经干细胞移植等。这些治疗方法中除了超早期( 发病3 h 内)溶栓治疗有效率高达21% ～ 93%，其他疗法效果并不确定。而且溶栓治疗因其严格的时间窗，意味着只有不到5% 的病人有机会进行这一治疗。因此，缺血性脑中风的病人约80% 留下不同程度的后遗症——神经功能缺损。

典型的缺血性脑卒中在临床上可按照病程分为3 期。第1 期急性期，脑卒中后1 个月内; 第2 期恢复期，脑卒中后2 ～ 6 个月内; 第3 期后遗症期，脑卒中6 个月后。补阳还五汤主要用于脑缺血恢复期及后遗症期治疗，是治疗脑缺血后遗症的首选方，临床应用疗效显著。因此在动物实验中我们观察的时间点最长达到缺血后21 d，这相当于人脑缺血后遗症期。本实验研究中，神经功能评分结果表明补阳还五汤能促进脑缺血后大鼠神经功能恢复。其作用机制有学者认为与促血管生成、扩血管、抗凝、溶栓等改善脑缺血局部微循环，减轻脑水肿及氧自由基损伤，保护脑组织，从而促进神经功能恢复。本实验室及国内其他实验室研究表明补阳还五汤能促进缺血后脑内神经干细胞增殖、迁移、分化，可能也是其促进缺血后神经功能恢复机制之一。通过比较各组动物脑梗死面积比，结果显示补阳还五汤各时间点分别较同时间相模型组脑梗死面积明显缩小。可能的原因有: 其一，补阳还五汤在脑缺血急性期起脑保护作用，抑制了大量神经元死亡与凋亡导致梗死面积变小; 其二，补阳还五汤促进缺血后脑组织再生、修复、代偿，而导致梗死面积较相应的模型组缩小; 二者也可能兼而有之。另外，通过比较补阳还五汤组与模型组缺血后海马、皮质组织学改变，结果表明补阳还五汤能明显改善细胞形态与排列，促进脑缺血损伤后组织修复。

总之，本研究证实了补阳还五汤具有降低脑缺血神经功能评分、减小脑梗死面积、改善脑组织细胞形态与排列的脑保护作用，为该药临床治疗缺血性脑卒中提供了有力的实验依据。

深度神经网络（DNNs）是 AI 领域的重要成果，但它的 “存在感” 已经不仅仅限于该领域。 一些前沿生物医学研究，也正被这一特别的概念所吸引。特别是计算神经科学家。 在以前所未有的任务性能彻底改变计算机视觉之后，相应的 DNNs 网络很快就被用以试着解释大脑信息处理的能力，并日益被用作灵长类动物大脑神经计算的建模框架。经过任务优化的深度神经网络，已经成为预测灵长类动物视觉皮层多个区域活动的最佳模型类型之一。 用神经网络模拟大脑或者试图让神经网络更像大脑正成为主流方向的当下，有研究小组却选择用神经生物学的方法重新审视计算机学界发明的DNNs。 而他们发现，诸如改变初始权重等情况就能改变网络的最终训练结果。这对使用单个网络来窥得生物神经信息处理机制的普遍做法提出了新的要求：如果没有将具有相同功能的深度神经网络具有的差异性纳入考虑的话，借助这类网络进行生物大脑运行机制建模将有可能出现一些随机的影响。要想尽量避免这种现象，从事 DNNs 研究的计算神经科学家，可能需要将他们的推论建立在多个网络实例组的基础上，即尝试去研究多个相同功能的神经网络的质心，以此克服随机影响。 而对于 AI 领域的研究者，团队也希望这种表征一致性的概念能帮助机器学习研究人员了解在不同任务性能水平下运行的深度神经网络之间的差异。 人工神经网络由被称为 “感知器”、相互连接的单元所建立，感知器则是生物神经元的简化数字模型。人工神经网络至少有两层感知器，一层用于输入层，另一层用于输出层。在输入和输出之间夹上一个或多个 “隐藏” 层，就得到了一个 “深层” 神经网络，这些层越多，网络越深。 深度神经网络可以通过训练来识别数据中的特征，就比如代表猫或狗图像的特征。训练包括使用一种算法来迭代地调整感知器之间的连接强度（权重系数），以便网络学会将给定的输入（图像的像素）与正确的标签（猫或狗）相关联。理想状况是，一旦经过训练，深度神经网络应该能够对它以前没有见过的同类型输入进行分类。 但在总体结构和功能上，深度神经网络还不能说是严格地模仿人类大脑，其中对神经元之间连接强度的调整反映了学习过程中的关联。 一些神经科学家常常指出深度神经网络与人脑相比存在的局限性：单个神经元处理信息的范围可能比 “失效” 的感知器更广，例如，深度神经网络经常依赖感知器之间被称为反向传播的通信方式，而这种通信方式似乎并不存在于人脑神经系统。 然而，计算神经科学家会持不同想法。有的时候，深度神经网络似乎是建模大脑的最佳选择。 例如，现有的计算机视觉系统已经受到我们所知的灵长类视觉系统的影响，尤其是在负责识别人、位置和事物的路径上，借鉴了一种被称为腹侧视觉流的机制。 对人类来说，腹侧神经通路从眼睛开始，然后进入丘脑的外侧膝状体，这是一种感觉信息的中继站。外侧膝状体连接到初级视觉皮层中称为 V1 的区域，在 V1 和 V4 的下游是区域 V2 和 V4，它们最终通向下颞叶皮层。非人类灵长类动物的大脑也有类似的结构（与之相应的背部视觉流是一条很大程度上独立的通道，用于处理看到运动和物体位置的信息）。 这里所体现的神经科学见解是，视觉信息处理的分层、分阶段推进的：早期阶段先处理视野中的低级特征（如边缘、轮廓、颜色和形状），而复杂的表征，如整个对象和面孔，将在之后由颞叶皮层接管。 如同人的大脑，每个 DNN 都有独特的连通性和表征特征，既然人的大脑会因为内部构造上的差异而导致有的人可能记忆力或者数学能力更强，那训练前初始设定不同的神经网络是否也会在训练过程中展现出性能上的不同呢？ 换句话说，功能相同，但起始条件不同的神经网络间究竟有没有差异呢？ 这个问题之所以关键，是因为它决定着科学家们应该在研究中怎样使用深度神经网络。 在之前 Nature 通讯发布的一篇论文中，由英国剑桥大学 MRC 认知及脑科学研究组、美国哥伦比亚大学 Zuckerman Institute 和荷兰拉德堡大学的 Donders 脑科学及认知与行为学研究中心的科学家组成的一支科研团队，正试图回答这个问题。论文题目为《Individual differences among deep neural network models》。 根据这篇论文，初始条件不同的深度神经网络，确实会随着训练进行而在表征上表现出越来越大的个体差异。 此前的研究主要是采用线性典范相关性分析（CCA，linear canonical correlation analysis）和 centered-kernel alignment（CKA）来比较神经网络间的内部网络表征差异。 这一次，该团队的研究采用的也是领域内常见的分析手法 —— 表征相似性分析（RSA，representational similarity analysis）。 该分析法源于神经科学的多变量分析方法，常被用于将计算模型生产的数据与真实的大脑数据进行比较，在原理上基于通过用 “双（或‘对’）” 反馈差异表示系统的内部刺激表征（Inner stimulus representation）的表征差异矩阵（RDMs，representational dissimilarity matrices），而所有双反馈组所组成的几何则能被用于表示高维刺激空间的几何排布。 两个系统如果在刺激表征上的特点相同（即表征差异矩阵的相似度高达一定数值），就被认为是拥有相似的系统表征。 表征差异矩阵的相似度计算在有不同维度和来源的源空间（source spaces）中进行，以避开定义 “系统间的映射网络”。本研究的在这方面上的一个特色就是，使用神经科学研究中常用的网络实例比较分析方法对网络间的表征相似度进行比较，这使得研究结果可被直接用于神经科学研究常用的模型。 最终，对比的结果显示，仅在起始随机种子上存在不同的神经网络间存在明显个体差异。 该结果在采用不同网络架构，不同训练集和距离测量的情况下都成立。团队分析认为，这种差异的程度与 “用不同输入训练神经网络” 所产生的差异相当。 如上图所示，研究团队通过计算对应 RDM 之间的所有成对距离，比较 all-CNN-C 在所有网络实例和层、上的表示几何。 再通过 MDS 将 a 中的数据点（每个点对应一个层和实例）投影到二维。各个网络实例的层通过灰色线连接。虽然早期的代表性几何图形高度相似，但随着网络深度的增加，个体差异逐渐显现。 在证明了深度神经网络存在的显著个体差异之后，团队继续探索了这些差异存在的解释。 随后，研究者再通过在训练和测试阶段使用 Bernoulli dropout 方法调查了网络正则化（network regularization）对结果能造成的影响，但发现正则化虽然能在一定程度上提升 “采用不同起始随机种子的网络之表征” 的一致性，但并不能修正这些网络间的个体差异。 最后，通过分析网络的训练轨迹与个体差异出现的过程并将这一过程可视化，团队在论文中表示，神经网络的性能与表征一致性间存在强负相关性，即网络间的个体差异会在训练过程中被加剧。 总而言之，这项研究主要调查了多个神经网络在最少的实验干预条件下是否存在个体差异，即在训练开始前为网络设置不同权重的随机种子，但保持其他条件一致，并以此拓展了此前与 “神经网络间相关性” 有关的研究。 除了这篇 这篇 研究以外，“深度学习三巨头” 之一、著名 AI 学者 Hinton 也有过与之相关的研究，论文名为《Similarity of Neural Network Representations Revisited》，文章探讨了测量深度神经网络表示相似性的问题，感兴趣的读者可以一并进行阅读。 Refrence： [1] [2]

这个应该没有什么特别的结论吧，只不过是因为爱因斯坦他的一些思维比我们更厉害而已