西南农业学报低温胁迫

植物组织培养及其应用研究概况在世界各国科学家的不断努力下，近几十年来，植物组织培养技术迅速发展。利用组织培养，不仅可以大量生产优良无性系，获得人类需要的多种代谢物质，还可获得单倍体、三倍体、多倍体及非整倍体。通过细胞融合可以打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲合性，在植物新品种的培育和种性的改良中发挥了巨大作用。组织培养的植物细胞是在细胞水平上分析研究的理想材料，从植物快繁、花药培养发展到细胞器培养、原生质融合以及DNA重组技术等，植物组织培养技术广泛应用于植物科学的各个领域及农业、林业、工业、医药等多种行业，已经成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。1 植物组织培养的基本概念、原理和试验步骤1．1概念植物组织培养是在无菌条件下，将离体的植物器官(根尖、茎尖等)、组织(形成层、花药组织等)、细胞(体细胞、生殖细胞等)、胚胎(成熟或未成熟的胚)、原生质体等在人工配制的培养基上培养，给予适宜的培养条件，诱发其产生愈伤组织或潜伏芽或长成完整的植株的技术。1．2原理 植物组织培养的依据是植物细胞的“全能性”及植物的“再生作用”。1902年，德国著名植物学家 G．Haberlandt根据细胞学理论提出了一个观点，“高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞，即植物体细胞，体细胞在适当的条件下具有不断分裂、繁殖并发育成完整植株的潜力”。1943年，美国人White在烟草愈伤组织中偶然发现形成一个芽，证实了G．Haberlandt的论点。 不同植物所需要的生长条件不同，所用的培养基也有所不同。较常用的基础培养基有MT、MS、 SH、N6、White等。在组织培养中，愈伤组织和胚状体能否形成是培育出新植株的关键。通过在基础培养基里添加一定浓度的外源激素，可以诱导出愈伤组织、胚状体、不定芽、根等器官，最终获得再生植株或次生物质。 用于植物组织培养的材料称为外植体，其主要形式有器官、胚胎、单细胞、原生质体等。根据外植体的不同，所需要的培养基种类、培养条件、外源激素的种类及比例等均不同。植物组织培养中，影响培养力的因素是多方面的，诱导愈伤组织成败的关键在于培养条件，植物激素是诱导愈伤组织和绿苗分化的关键因素。最常用的诱导愈伤组织的生长素是IAA、NAA和2，4一D，所需浓度为O．01～10 mg／L。最常用的细胞分裂素是KT和ABA，使用浓度为O．1～10 mg／L。KT的主要作用是促进细胞分裂和愈伤组织分化。ABA对植物体细胞胚的发生与发育具有重要作用。各类植物激素的生理作用虽有相对专一性，但是植物的各种生理效应是不同种类激素之间相互作用的综合表现。1．3试验步骤1．3．1选择和配制培养基 培养基是植物组织培养中的“血液”，血液的成分及其供应状况直接关系到培养物的生长与分化，因此了解培养基的成分、特点及其配制至关重要。1．3．2灭茵灭菌是组织培养中的重要工作之一，通常采用物理的或化学的灭菌方法。培养基用常压或高压蒸煮等湿热灭菌、器械采用灼烧灭菌、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌、不耐热的物质采用过滤灭菌、植物材料表面用消毒剂灭菌、物体表面用药剂喷雾灭菌、接种室等空间采用紫外线或熏蒸灭菌。1．3．3接种将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块放入培养基，整个接种过程要在无菌条件下进行。 ．4培养把培养材料放在有一定光照和温度等条件的培养室里，使之生长、分裂和分化，形成愈伤组织或进一步分化成再生植株。1．3．5试管苗驯化移栽 试管苗是在特殊环境条件下生长的幼苗，与自然生长的幼苗有很大差异，只有通过驯化，使之适应自然环境后才能移栽。2 植物组织培养的应用2．1植物快速繁殖和无病毒种苗生产植物快速繁殖技术始于20世纪60年代，法国的Morel用茎尖培养的方法大量繁殖兰花获得成功，从此揭开了植物快速繁殖技术研究和应用的序幕。目前，通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有100多科1 000种以上，有的已经发展成为工业化生产的商品。世界上80％～85％的兰花是通过组织培养进行脱毒和快速繁殖的。培养的植物种类也由观赏植物逐渐发展到园艺植物、大田作物、经济植物和药用植物等。在我国，同类的研究始于20世纪70年代。马铃薯无毒种薯和甘蔗种苗已在生产上大面积种植，30余种植物已进行规模化生产或中间试验。利用组织培养进行植物快速繁殖及无病毒种苗生产，不仅能够挽救珍惜濒危物种，而且能够解决植物野生资源缺乏的问题。2．2植物花药培养和单倍体育种 将植物花药培养成单倍体植株，再经过染色体加倍，能很快得到纯合的二倍体，这样将大大缩短育种年限。到目前为止，世界上通过花粉和花药培养已获得了几百种植物的单倍体植株。印度科学家应用这种方法培育的水稻品系，比对照产量提高15％～49％。韩国先后育成了5个优质、抗病、抗倒伏的水稻品种。我国自20世纪70年代开始该领域的研究，已经培育了40余种由花粉或花药发育成的单倍体植株，其中有10余种为我国首创。玉米获得了100多个纯合的自交系；橡胶获得了二倍体和三倍体植株。仅“九五”期间就育成高产、优质、抗逆、抗病的农作物新品种44个，种植面积超过660万 hm2。2．3植物胚胎培养杂交育种中，杂种胚常常败育，因此将早期生长的胚取出，应用组织培养方法，就有可能培育出杂交植物。已经有100篇以上幼胚培养成为植株的报道。国内外科学家应用植物胚胎培养技术获得了多种远缘杂交的重组体、栽培种和杂交品种。2．4植物愈伤组织或细胞悬浮培养利用植物愈伤组织或细胞悬浮培养可以生产用于预防和治疗疾病的植物次生代谢产物。近年来，这一领域的发展极为迅速，已经研究了400多种植物，从培养细胞中分离到600多种次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于原植物，20种以上干重超过原植物的1 9，6。例如，从薯芋愈伤组织和悬浮细胞生产的diosgenin用于合成甾体药物。最近抗癌药物紫杉醇一红豆杉细胞培养物，可用75t发酵罐培养，已达到商业化生产水平。另外，达到商品化水平的还有紫草、人参、黄连、老鹳草等；长春花、毛地黄、烟草等已实现工业化生产；牙签草、红花等20多种植物正在向商品化过渡。2．5细胞融合与原生质体培养自1960年英国学者Cocking首次利用纤维素酶从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功以来，到1990年已有100种以上植物的原生质体能再生植株。我国获得了30余个品种的原生质体再生植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和经济作物，如大豆、水稻、玉米、小麦、谷子、高梁、棉花等。在木本植物、药用植物、蔬菜和真菌原生质体培养方面的进展也十分迅速。国外已先后获得了种内及种间的体细胞杂种植株。植物原生质体培养还可应用于外源基因转移、无性系变异及突变体筛选等研究，因而越来越受到人们的重视。2．6植物细胞突变体筛选植物细胞突变体的筛选最早始于1959年，G． Melchers在金鱼草悬浮细胞培养中获得了温度突变体。1970年，P．S．Carlson，H．Binding和Y．M． Heimer等分别分离出烟草营养缺陷型细胞、矮牵牛抗链霉素细胞系及烟草抗苏氨酸细胞系。迄今为止，已经在不少于15个科45个种的植物细胞培养中筛选出100个以上的植物细胞突变体或变异体。其中包括抗病细胞突变体，如玉米抗小斑病突变体和小麦抗赤霉病、根腐病突变体；抗氨基酸及其类似物细胞突变体，如甘蓝型油菜抗HYP突变体[263；抗逆境胁迫细胞突变体，如水稻耐盐突变体和小麦抗盐突变体；抗除草剂细胞突变体及营养缺陷型细胞突变体，如玉米抗除草剂变异体；株高突变体的筛选，如水稻矮秆变异体。2．7植物体细胞胚胎和人工种子1958年，Reinert在胡萝卜的组织培养中最先发现了体细胞胚胎(胚状体)。据不完全统计，能大量产生胚状体的植物有43科92属100多种。一些重要作物如水稻、小麦、玉米、珍珠谷等，也能通过离体培养产生胚状体。这些胚状体用褐藻酸钠等包埋，再加上人工种皮，就形成了人工种子。人工种子的优点是：繁殖快速，成苗率极高；不受气候影响，四季皆可工厂化生产。上世纪80年代初，美、日、法等国家相继开展了人工种子的研究，我国也于“七五”期间开展了此项研究，并于1987年列入了国家“863”高技术研究发展计划。2．8 植物组织细胞培养物的超低温保存与种质库建立植物细胞全能性的发现和证实，为植物种质资源的长期保存开辟了一条新途径。采用液氮超低温保存技术，能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持原来的遗传特性。如建立茎尖分生组织培养物的超低温保存种质库，不仅可以防止种质的遗传变异和退化，而且可以长期保存无病毒的原种。2．9 植物组织培养与转基因技术的应用 我国第一个T—DNA插入突变体库的构建和研究为我国水稻功能基因组学研究奠定了良好的技术和材料基础，为确保我国拥有一批有自主知识产权的基因资源做出了积极贡献。由中国水稻研究所农业部水稻生物学重点开放实验室和中科院上海植物生理研究所合作，通过建立大规模、高效的农杆菌介导的转基因技术体系，将玉米转座子Ac—Ds等外源基因导入水稻未成熟胚和种子诱导的愈伤组织，获得了1．2万个独立的T—DNA插入株系，并构建了水稻突变体的数据库。 3 展望植物组织培养研究与应用是20世纪科技进步的重大成果之一，为研究植物生长发育、抗性生理、激素及器官发生与胚胎发生等提供了许多良好的实验材料和有效途径。植物组织培养方法不断提高的同时，也相应拓宽了其应用范围。由于组织培养在人工控制的条件下进行，容易掌握花芽分化和开花成因；通过胚胎培养，能够得到杂种或自交种；通过分离单倍体细胞，能培育纯合的二倍体优良品系；提高育种多样性的同时缩短了育种时间；通过突变体筛选，提高植物的品质，增强抗逆境胁迫能力，扩大植物的生长范围；将体细胞冷藏在低温下，建立基因库，达到保存物种的目的；获得药用价值高和工业生产所需要的次生产物，加快药物生产的时间并且减少了单纯依靠天然植物的被动性。植物组织培养技术已经渗透到科研、生产和生活各个领域，必将日臻完善。黑龙江农业科学2006，(3)

1.曲靖烟区土壤有效中量元素的空间变异特征及影响因子研究.核农学报，2011/032.烟叶质量评价指标间的典型相关分析.中国烟草学报，2011/支持下的马龙县植烟土壤有效态微量元素评价.中国烟草学报，2011/034.曲靖植烟土壤养分空间变异及土壤肥力适宜性评价.应用生态学报，2011/015.基于主成分回归的曲靖C3F等级烤烟评吸质量估算模型.中国烟草学报，2011/016.不同焦油量烤烟化学成分差异.中国烟草学报，2011/027.烟草残体腐解液及其组分的化感潜力研究.中国烟草学报，2010/068.云南曲靖不同海拔烟区土壤和烟叶硼含量的分布状况及相关性研究.中国烟草学报，2010/069.云南大理烤烟土壤微生物动态变化研究.中国烟草学报，2010/0510.部分生态因素对烤烟挥发性和半挥发性有机酸含量影响的研究.中国烟草学报，2010/0511.云南烤烟钾含量时空变异特性研究.中国烟草学报，2010/0512.气候和土壤及其互作对湖南烤烟还原糖、烟碱和总氮含量的影响.生态学报，2010/1613.土壤和气候及其互作对湖南烤烟部分中性挥发性香气物质含量的影响.应用生态学报，2010/0814.曲靖烟区烤烟铅、铬、汞含量及其与土壤环境因子的相关性.烟草科技，2010/0715. 不同烤烟品种各部位烤烟成熟过程中非挥发有机酸含量变化的研究.中国烟草科学，2010/0416. 低钾胁迫下不同烤烟品种根系生长和根毛形态的差异.中国烟草学报，2010/0317.酶解-离子色谱法测定烟草中的果胶.化学研究，2010/0318. 复烤片烟醇化中几种化合物含量及相关酶活性变化.中国烟草科学，2010/0319.云南曲靖烟区土壤肥力状况综合评价.中国烟草学报，2010/0220. 云南烤烟不同品种和产区还原糖的差异分析.西南农业学报，2010/0421.中国主要烟区烤烟氯含量区域特征研究.中国土壤与肥料，2010/0222. 单料烤烟烟气粒相物与质量评价指标间的相关性研究.中国烟草科学，2010/0123. 不同烤烟品种对土壤微量元素响应的研究.中国烟草科学，2010/0124.土壤与气候及其互作对湖南烤烟还原糖与烟碱含量的影响.中国烟草学报，2010/0125 湖南和云南烤烟单料烟感官质量因子分析.中国烟草学报，2010/0126.云南烤烟多酚含量空间变异分析.作物学报，2010/0127. 凝胶渗透色谱-高效液相色谱-串联质谱法同时测定烟草中3种抑芽剂残留.分析实验室，2010/0128. 发展特色烟叶是重点骨干品牌和优质烟区实现共赢的合作平台.中国烟草学报，2009/0629. 湖南烟区中部烤烟总糖含量状况及与评吸质量的关系.中国烟草学报，2009/0530.湖南烤烟烟碱含量空间分布特征及与香吃味的关系.中国烟草科学，2009/0531. 烟碱致病性和药用研究.中国药物滥用防治杂志， 2009/0532. 湖南烤烟物理性状比较及聚类评价.中国烟草科学，2009/0333.湖南省烤烟生长比较优势的县域分布研究[J].中国烟草学报，2009/0334. 成熟期土壤水分状况对烤烟挥发性香气物质及主要化学成分的影响.中国烟草学报，2009/0335. 两阶段聚类分析在烤烟外观质量评价中的应用,农业机械学报,2009,40(6)36. CO生理学机理及在卷烟烟气中的研究.中国医药实践杂志，2009/04，22-2337.烟草果胶的提取分析研究进展，广州化学, 2009/ 0138. 液质联用法在烟草农药残留检测方面的研究进展，广西轻工业， 2009/ 0239. UV-B 对烟草生长发育及次生代谢的影响.中国生态农业学报, 2009/0140.烤烟不定根对主要营养元素吸收能力的研究.中国烟草学报，2008/0641. 云南不同产区主栽烤烟品种烟叶物理特性的分析.中国烟草学报，2008/0642. 影响我国卷烟消费需求的主要经济指标分析.中国烟草学报，2008/0443. 烤烟品种耐寒性及相关生理指标的研究.中国烟草科学，2008/0344. 多指标正交试验数据的优化分析及应用.中国烟草学报，2008/0245. 烟叶质量评价指标间的相关性研究.中国烟草学报，2008/0246. 不同成熟度烟叶结构显微分析.中国烟草科学，2008/0247.构建中式卷烟优质特色烟叶原料保障体系是中国烟草在新形势下的战略选择.中国烟草学报，2008/0148. 烟草早花机理及控制的研究进展.中国烟草学报，2008/0149.不定根对烤烟根系生长及相关酶活性的补偿效应.中国烟草科学，2008/0150. 不同烤烟品种花芽分化与生育进程对苗期低温的敏感性研究.中国烟草科学，2007/0651.烘丝工艺参数对烘后烟丝质量影响的研究.中国烟草学报，2007/0652. 湖南烟区烤烟糖含量的空间变异特性研究.环境科学杂志，2007/653. 缺素对烤烟叶片腺毛生长发育影响的研究.中国烟草学报，2007/0554.不同部位烟叶海绵与栅栏细胞中主要化学成分研究.中国农业科学，2007/1055.五个烤烟品种叶片栅栏组织和海绵组织化学成分研究.中国烟草学报，2007/0656.湖南烤烟硫含量的区域特征及其对烟叶评吸质量的影响.应用生态学报，2007/0557. 湖南烟区烤烟铅含量的空间变异特性研究.环境科学学报，2007/1058.不同卷烟和烟叶中主要多酚含量的差异.中国烟草学报，2007/0659.湖南烤烟外观质量量化评价体系的构建与实证分析.中国农业科学，2007./0960. 基于稳健性设计的筛分加料工序质量评价和参数优化.中国烟草学报,2006/561. 湖南不同烤烟中非挥发性有机酸含量的差异.中国烟草学报，2006/462.烤烟成熟过程中叶片解剖结构和质体的细胞学研究.作物学报，2006年.期63. 不同产地烤烟叶中绿原酸和芸香苷的含量分析.天然产物分析研究,2006/0464. 钾对病毒侵染后烟草叶片内源保护酶活性的影响.中国农业科学 . 根际酸度对烤烟生长、与养分吸收的影响.土壤 .白肋烟品种在不同氮水平下对主要养分吸收的研究.种子 2000. . 磷钙锌对烟草生长、抗逆性保护酶及渗调物的影响 土壤 .钾素对花叶病毒侵染后烤烟过氧化物酶活性的影响.烟草科技. 2000. . 不同烤烟品种对根际pH适应能力的研究.中国农业科学.1999. . 不同烤烟品种对钾素响应的研究.土壤 1998. Vol30 . 烟草品种苗期对钾素响应能力的研究.中国烟草科学. 1998. No272. K、Ca、Zn对烤烟种子萌发及幼苗生长的影响.中国烟草科学. No173. 综合栽培措施对烟草根系特征参数及叶片质量的影响.土壤肥料..干旱胁迫钾对烤烟生长及抗旱性的生理调节.中国烟草.1998. . 转复制酶基因抗病毒烟草的研究.中国烟草学报. . Effect of Fertilizer N forms on Physiological Metabolism and potassium Uptake of Flue--Cured Tobacco. PEDOSPHERE . 烟草生理与生物化学[M].中国科技大学出版社,199678. 氮肥用量、形态对烤烟生长和钾素吸收的影响.中国烟草学报. 1996. .培土、施肥对烟草根系发育及氮钾吸收效率的影响.中国烟草学报. (1)80.分次供钾对白肋烟钾素吸收分配的影响.中国烟草. . 中国烟草病虫害彩色图志.安徽科技出版社.(6)82. K+与相伴阴离子对烟草有关生理代谢的影响.中国烟草学报.1994. .烟草抗旱生理的研究.中国烟草. . 茶树种子在贮藏中的生理生化—不同状态下茶子萌发过程的分析.福建茶叶,1986,285. 不同修剪技术对茶树光合呼吸特性的影响.贵州茶叶1983(1)86. 茶叶年生长周期的研究.贵州茶叶.. 茶树同化物产生的探讨——采摘对茶树光合、呼吸作用的影响.茶叶通讯. 提高茶树生长的经济系数—今后茶叶科研中的课题.茶叶通讯.. 茶树同化产物的探讨一枝梢生长与同化产物代谢运输的关系.茶叶通讯.. 关于茶树抗寒力的探讨.茶叶.1982. .不同电场强度处理对茶叶种子萌发性的影响.中国茶叶.