克隆技术公开发表的论文

．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境――子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个完全的无性繁殖过程!

基因克隆技术给人类生活带来美好的前景，故寄予了无限的期望。下面是我整理了基因克隆技术论文，有兴趣的亲可以来阅读一下!

差异表达基因克隆技术的新进展

提要 分离并克隆差异表达基因是 目前 功能性基因 研究 的热点。mRNA差异展示是筛选差异表达基因最有效的技术之一，它的主要不足是有一定假阳性。RDA、SSH、DSD、LSH技术能够克服假阳性，但也具有一定的不足，应根据需要选择运用。随着能扩增长片段及具有自动校正功能的Taq酶出现及 应用 ，这些技术将会不断完善与 发展 ，具有广阔的应用前景。

关键词 差异表达基因;克隆

现代 分子生物学研究表明，人类基因组约由10万左右的不同基因组成，这些基因选择性的表达决定了机体整个生命过程，基因表达的变化处于控制生物学调节机制的中心位置。因此，分离并克隆差异表达基因不仅有助于阐明生命的粤秘，而且还能为基因诊断与 治疗 提供重要的 理论 依据。近几年来，差异表达基因克隆技术不断完善与发展，已成为研究肿瘤和疾病等相关基因的重要手段。

一、mRNA差异展示

mRNA差异展示(mRNA differential display,DDRT-PCR)是目前筛选差异表达基因最有效的 方法 之一，其基本原理是：3´端采用锚定引物，与mRNA3´poly a结合，进行反转录，形成mRNA：cDNA杂交分子，5´端采用20条随机引物，与锚定引物一起进行PCR扩增，其产物经测序胶显示出来，再回收鉴定克隆差异条带。1992年Liang和Pardee[1]建立此技术时，5´端采用20条随机引物，每条由10个碱基组成，3´端采用12条引物即T12MN(M=A、C或G，N=A、G、C、T)。这种组合从统计学上几乎能完全覆盖所有的mRNA序列，差异表达的基因会全部呈现出来。实践证明，这种方法有效，但假阳性率在50%～70%左右，差异条带在Northern印迹上重现性差，后续处理也比较复杂。1994年Ito[2]等对3´端引物进行了改进，把12条引物改为3条，即T12A、T12C、T12G，使得实验操作简化。1995年Ayala[3]等提出了在3´端锚定引物与5´端随机引物上皆增加10个碱基，使得上下游引物Tm值在60℃左右，PCR循环参数也改为前5个循环采用Liang和Pardee推荐的参数，即94℃30s，40℃2min,72℃30s。经这样改进，显著地增强了差异条带的重复性和敏感性，同时使得差异条逼带的克隆十分方便。1996年4月，Liang和Pardee[4]对5´端此物进行了改进，引物条数改为8条，皆带上HindⅢ酶切位点，每条由13个碱基组成，3´端锚定引物采用3条，也带上HindⅢ酶切位点，每条由18个碱基组成，PCR循环条件仍采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,40个循环，最后在72℃延伸7min。1998年[5]我们在Liang和Pardee改进的基础上，对PCR循环参数进行了改进，即前5个循环采用94℃30s,40℃2min,72℃30s,后35个循环采用94℃30s,55℃2min,72℃30s，最后在72℃延伸7min。经这样改进，既保持了扩增效率，又增强了差异条带的特异性及重复性，降低了假阳性率。

总之，mRNA差异展示具有简便、快速、所需起始材料少、同时可在多个材料之间或不同处理材料之间进行比较等优点，但具有较高频率的假阳性和短小的差异片段的缺点，给后续处理带来一系列 问题 ，虽然此技术经过了一些起改进，但这两个缺点仍限制着此方法的充分应用。

二、代表性差示 分析

代表性差示分析(representational difference analysis,RDA)最早由Lisitsyn等提出的。1994年，Hubank和Schatz[6]将其应用于克隆差异表达基因，其基本原理是：靶方(Tester,T)和驱动方(Driver,D)的cDNA在进行差方式分析前均用一种识别4碱基序列的限制酶作切割处理，形成平均长度为256bp的cDNA片段代表群，第一次T与D杂交反应时，两者总量比为1：100，第二次增加到1：400，第三次增加到1：8000，再利用PCR以指数形式扩增双链模板，而仅以线性形式扩增单链模板这一特性，通过降低cDNA群体复杂度和多次更换cDNA两端接头，来特异扩增目的基因片段。特别是T减D杂交反应后仅设置了72℃ 复性与延伸及95℃变性这两个循环参数，共20个循环，从而使PCR产物特异性大大提高。此技术最大的优势是差异条带在Northern印迹上重现性好，假阳性少。缺点是所需起始材料较多，更多信赖于PCR技术，T与D之间若存在较多差异，或T中存在某些基因上调表达，则难达到预期目的，而且工作量比DDRT-PCR大，周期长。

三、抑制性扣除杂交

抑制性扣除杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)，是1996年Diatchenk[7]等提出的一种新的克隆基因技术，其基本原理是：先将T与D方cDNA用限制酶切割为小片段，将T方平均分为两份，分别连接不同的接头，然后与过量的D方cDNA进行不充分杂交。根据复性动力学原理，浓度高的单链分子迅速复发，而浓度低的单链分子仍以单链形式存在。然后混合两份杂交样品，同时加入新的变性D方cDNA进行第二次扣除杂交，杂交完全后补平末端，加入合适引物接头(接头1与接头2引物)进行PCR扩增。当DNA两条链含相同接头时，其PCR扩增受到抑制，而含不同接头的双链DNA分子才可进行指数扩增，其产物即为目的片段。

此技术避免了消减杂交过程中分离单双链DNA的步骤，可成千倍地扩增目的片段，能分离出T方上调表达的基因，与DDRT-PCR相比，具有假阳性少重复性强的优点，它的最大不足就是需要较多的起始材料，更多依赖于PCR技术，不能同时进行数个材料之间或不同处理材料之间的比较。

四、差异消减展示

差异消减展示(differential subtraction display,DSD)是1998年Jose等[8]提出的，它是在DDTR-PCR呈现出差异条带之后，同时回收差异条带与对照方的相应范围的条带，靶方回收的差异条带用非生物素标记的引物与dNTPs进行PCR扩增，而对照方回收的差异条带用含生物素标记的dATP的dNTPs进行PCR扩增，其产物进行消减杂交，用链亲和素去除共有的产物，剩下的产物由带有α-32P dATP的dNTPs进行扩增，再重复差异展示，回收差异条带并克隆。此技术最大的优势是获得差异条带在Northern印迹上重现性好，假阳性少，敏感性强，可获得长片段，起始材料要求少，可获取低丰度差异表达基因，缺点是步骤繁琐，工作量大，周期性长，更多依赖于PCR技术。

另外，赵忠良博士把长片段PCR扩增(LPCR)与消并减杂交技术结合起来，建立了LPS技术，并运用此技术从抗原呈细胞中获取了170多个差异表达基因。此技术的基因原理是：T与D方分离出cDNA后，运用5´端帽子引物与3´端锚定引物，对cDNA进行大量扩增，其产物直接进行消减杂交，然后过柱子，去除相同的基因，剩余的部分再与D方cDNA进行二轮消减杂交，再过柱子，去除非差异部分，剩下的差异部分进行第三轮消减杂交，其产物进行分级分段克隆。这种 方法 最大的好处是：起始材料需要少，可获得差异基因，假阳性少，有可能获得全长差异表达基因。

总之，随着高效扩增的Taq酶与具有自动校正功能的Taq酶的出现，长片段PCR扩增技术的优化，差异表达基因克隆技术将会不断 发展 ，但 目前 主要有以上几种方法，各有其优缺点， 研究 者应根据自己的实际情况，选择合适的技术方法，以其达到自己预期的目的。

参考 文献

1 Liang P et al.Science,1992:257(14):967

2 Ito T et al.FEBS letters,1994;351:231

3 Ayala M et al.Biotechniques,1995;18(5):842

4 GenHunter Corporation,RNA imageTM,kit(cat NO.G501) for mRNA diflerential& nbsp;display,1996,April,12

5 Cui DX et al.Journal of the Fourth Military university,1998;18(6):601

6 Hubank M et al.NuclEic Acids Res,1994;22:5640

7 Diatchenko L et al.Proc Natl Sci USA,1996;93:6025

8 Jose RP et al.Analytical Biochemistry,1998;257:161

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