Smileの夏天
这篇论文中所值得关注的就是将有一种新的技术将被进行研发,这些技术就是基于cas6的rna荧光追踪技术,从中可以看出这是一个非常强大的生物科学技术,并且这项技术目前已经经过了一定的实验,正处于新技术的研发过程中,但是从中也可以看出,目前并没有突破性的研究。
小蘑菇110
韩春雨在预印本网站BioRxiv上发表了一篇关于基因编辑的新文章:Background free tracking of single RNA in living cells using catalytically inactive CasE。
文章共有5名作者,依次为Feng Gao, Yue Sun, Feng Jiang, Xiaoyue Bai, Chunyu Han,工作单位均为河北科技大学基因编辑研究中心。其中,韩春雨为通讯作者。
据了解,论文中提到的CasE是Ⅰ-E型 CRISPR复合物的核心成分,它通过结合特定的茎环区域单独处理pre-crRNA,称之为 CasE Binding S,简称为CBS。CasE保守His20参与催化活性,ΔHis26-TtCse3突变的CasE(dCasE)则失去了催化活性,但仍然与其靶标紧密结合。
在该研究中,通过将 split 荧光与dCasE的N端和C-末端(ΔHis20)融合,构建了活体RNA跟踪工具VN-dCasE-VC。该系统仅在存在靶RNA时才发出荧光,从而增强信噪比。
在活细胞中进行可视化的RNA追踪,不需要特定的亚细胞分布。CasE-GFP和dCasE-GFP在HEK293T细胞中的高水平表达和均匀分布表明CasE和dCasE适合于活细胞中的RNA操作。
为了测试CasE在哺乳动物细胞中表达时是否具有强活性,作者构建了“关闭”报告基因质粒CBS-GFP-N1。它由5′-UTR中的GFP mRNA和CasE结合位点(CBS)组成。当CasE被引入系统时,GFP表达水平急剧下降。
同时,为了进一步测试CasE活性,作者还构建了“开启”报告基因质粒RED-16×CBS-Lin28-C1,其中CBS插入RED单体基因的3′-UTR区和Lin28的上游。Lin28是RNA核保留信号,在其3′-UTR中具有lin28信号的RED单体mRNA几乎不能翻译成蛋白质。
CBS-CasE依赖限制性切断lin28信号并从核释放靶mRNA用于翻译(图1E和图1F)。这些表明CasE可以结合并切割哺乳动物细胞中的CBS。
另外,为了将dCasE-CBS相互作用设计到RNA追踪系统中,作者通过将split-FP5-7与dCasE蛋白结合。发现一个版本,即VN-dCasE-VC很难发出荧光,这可能是由于不正确的折叠或不稳定的状态,但是当与靶RNA(CBS)结合时,可以在荧光显微镜下清楚地捕获荧光信号,即使VN-dCasE-VC表达质粒的转染剂量非常低。
接下来,作者使用VN-dCasE-VC系统追踪哺乳动物细胞中过表达的β-肌动蛋白(β-Actin)的mRNA,VN-dCasE-VC系统在细胞质中显示出强荧光。此外还观察到,向靶mRNA添加更多CBS可改善信号,荧光追踪更清晰,因此,可以通过增加CBS的数量来检测低丰度的mRNA。
总的来说,韩春雨团队发明了一种新的RNA追踪工具,将其命名为VN-dCasE-VC,该系统能够追踪活细胞中没有背景的特定RNA,通过荧光将其可视化。
目前已有两种活细胞RNA追踪成像工具,一种是MS2,一种是Cas13a,韩春雨团队开发的dCasE系统,成像效果由于MS2,而且,dCasE蛋白的分子量为22kDa,远小于Cas13a的130kDa,dCasE的小分子量更容易递送至细胞内,因此更适合用于活细胞的RNA追踪。
鹿鹿小宝贝
时隔六年,韩春雨再发表新论文,文中哪些信息值得关注?下面就我们来针对这个问题进行一番探讨,希望这些内容能够帮到有需要的朋友们。
2022年1月21日,韩春雨在期刊(IF=16.971)发布了全新研究论文,落款企业为河北科技大学基因编辑研究中心。这间距他那时候造成极大的关注和异议的NgAgo研究论文早已过去快6年时间。
在这篇新论文中,韩春雨团队开发设计了一种新的根据Cas6的RNA荧光追踪服务平台,其具备更多的精确度和非特异。
该研究称NgAgo对真核生物(包含人)具备基因编辑技术工作能力。该研究取得成功迅速在全世界范畴内爆红,韩春雨教师先前籍籍无名,几乎一夜之间变成学界网络红人,被赞扬为“在三流学校获得全球一流原创设计成效,摆脱国际性基因编辑技术垄断性”。
该论文通讯作者为韩春雨,第一作者为高峰期,浙江大学专家教授沈啸为一同通讯作者,但在后面改动版本号中,沈啸从创作者名册中去除开。
2016年8月,河北科技大学创立基因编辑研究中心,方案资金投入资产逾2亿人民币。但NgAgo的研究成效引起普遍怀疑。
2017年8月3日,韩春雨撤销该论文。2018年8月31日,河北科技大学取消了韩春雨所获取的光荣称号,停止了韩春雨团队担负的科研课题并取回了科研费,取回了韩春雨团队所获校科学研究业绩考核奖赏。
2019年4月4日,预印本bioRxiv发表了一篇来源于美国普渡大学研究工作人员的研究论文,表明NgAgo根据Dna内切酶活力受体提高大肠埃希菌的同源重组。该研究表明NgAgo可以编写原核生物,但不可以编写真核生物基因。详细信息点一下:NgAgo可在原核生物上基因编辑技术
RNA在体细胞中的精准定位与其说作用息息相关,因而,开发设计用以追踪RNA在体细胞中遍布的技术性巨大地推动了RNA分子生物学的研究。近期,荧光蛋清标识的Cas9和Cas13在体细胞RNA追踪中的自主创新运用进一步充实了这一行业的研究辅助工具。
殊不知,Cas9和Cas13服务平台及其普遍采用的MS2-MCP技术性无法处理高声音分贝的问题。Cas6是I-E型CRISPR分子伴侣的关键部件,它根据鉴别具备Cas6融合结构域的茎环RNA完成融合并激光切割pre-crRNA。pre-crRNA的Cas6融合结构域与Cas6融合后可诱发Cas6的构像更改,造成其N端和C端并排。运用这一特点,韩春雨等人设计方案了一个根据Cas6的电源开关服务平台,用以在身体内检验和追踪总体目标RNA。
将split-Venus片段与来源于大肠埃希菌的内切圆核酸酶活力缺失的Cas6(dEcCas6)的N端(Venus-N,VN)和C端(Venus-C,VC)融合,结合的嵌合体VN-dEcCas6-VC与目地RNA融合时才会造成荧光。
因为其荧光相辅相成是由Cas6的变构电源开关受体的,因而韩春雨团队将其取名为根据Cas6的荧光相辅相成服务平台(Cas6FC)。
在体细胞中,Cas6FC可以几乎没有声音分贝的检验总体目标RNA。除此之外,只需在有兴趣的RNA中标识一个长为29nt的CBS团本,就能开启Cas6FC荧光,这极大降低了总体目标RNA构想和市场定位的潜在性更改的概率。
总体来说,韩春雨团队开发设计了一种新的根据Cas6的RNA荧光追踪服务平台,其具备更多的精确度和非特异。
值得一提的是,这篇论文的具体内容早在2019年7月份,就在预印本bioRxiv上线。如今这也是通过同行评议后宣布发布。
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