PCR是很多学术用语的缩写，我知道一种是生物上用来克隆基因的技术。至于医学上的，好像是关于口腔的
分子生物学上的；聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）。
PCR是分子生物学的关键技术，又是常规技术。它的出现极大地推动了分子生物学的发展，旋即被迅速推广并应用到生命科学的各个领域。 关键词：PCR、发展简史、基本原理、基本操作、主要应用 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）是体外扩增DNA序列的技术。它与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个分子生物学实验工作的基础。在这三种技术中，PCR方法理论上出现最早，实践中应用也最广泛。PCR技术使对微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可以使核酸研究脱离活体生物。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，它极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。 PCR技术发展简史 人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。 PCR技术的基本原理和操作 1. PCR的基本原理 PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。 2. PCR的基本成分 PCR包括7种基本成分：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。 模板DNA：包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。除此之外，PCR反应还可以直接以细胞为模板。 特异性引物：是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。 热稳定DNA聚合酶：这是PCR技术实现自动化的关键。热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离的：一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，另一类是嗜热古细菌。现在又出现了一种兼顾了几种DNA聚合酶特点的混合型酶。 脱氧核苷三磷酸（dNTP）：是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。 二价阳离子：常用到Zn2+和Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。 缓冲液：一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到之间。 一价阳离子：一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善扩增的产物质量。 PCR的基本操作 PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。PCR技术的基本反应由三个步骤组成： 1. 变性：通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除； 2. 退火：将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合； 3. 延伸：将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。 以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。 PCR的主要应用 最初建立PCR是为了扩增已知序列的靶基因。因为在PCR方法问世以前，要获得一个靶基因，必须建立基因文件库，然后从成千上万的菌落中通过Southern blot 杂交筛选含有靶基因的克隆。这样既费时又费钱，特别是在克隆真核生物基因时难度更大。自从建立了PCR方法以后，使克隆已知序列的基因变得非常容易。为了适应分子生物学的快速发展，PCR方法也得到了不断发展，现在PCR已应用到生命科学的各个领域。 1. 基础研究方面的应用 目前从事分子生物学的实验室和研究人员，几乎每天都在使用PCR，可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。因此，PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法，可用于达到以下目的： l 扩增目的基因和鉴定重组子； l 克隆基因； l 基因功能和表达调控的研究； l 基因组测序； l 制备单链模板； l 致突变； 2. PCR在临床上的应用 l 在遗传学上的应用：人类的遗传性疾病是因为某一碱基序列发生了突变，使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点，通过PCR结合限制片段长度多态性分析（PCR-RFLP），就可以从基因的水平对遗传性疾病进行分析。例如，血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病，患者体内缺乏凝血因子FVIII这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变，产生了一个新的PstI酶切点，因此可以使用PCR-RFLP对血友病进行诊断。PCR还可以用来检测遗传性耳聋和Leber遗传性视神经病。 l 在肿瘤研究中的应用：PCR已日益广泛应用于肿瘤的病因与发病机理研究以及肿瘤诊断与治疗的研究中。例如，差异显示PCR技术能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物，并用于肿瘤早期诊断、判断预后及疗效评估。另一方面，在使用普通放疗、化疗的同时可结合定量PCR技术检测微小残留病灶，以进一步改进治疗方案。此外，由于癌症的发生在一定意义上是单个细胞分子发生变化，因而可以使用单细胞PCR技术对癌症的发病机理进行研究。 l 检测病原体 l 在基因分型中的应用：当进行器官移植时并须先组织配型工作，此时常应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）进行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段长度多态性也可以用于对HLA的分型。 3. 在法医学中的应用 例如：最早应用DNA限制性片段长度多态性结合PCR-RFLP来进行法医学个体识别和亲子鉴定。目前发现在真核生物基因组编码和非编码序列中的短串联重复序列的重复次数在个体间存在着差异，因此可以使用短串联重复PCR技术对其进行分析。使用PCR技术进行法医鉴定的优点是样品用量小并且适于对高度降解材料的检测。除刚才提到的之外，可变数目串联重复序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法医学个体识别和亲子鉴定。 所以，综上所述，PCR的确是一种分子生物学研究的基础技术。在它30多年的发展中衍生出了诸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突变PCR和定量PCR等十几种不同的技术方法。PCR技术可以为基因工程提供目的基因，并广泛地应用于个体识别、亲子鉴定、免疫配型、疾病诊断等方面。可以说，PCR已经渗透到了生命科学的各个领域。21世纪是生物工程的世纪。我相信，在今后的发展中PCR技术会不断地得到扩充和完善，PCR技术也将发挥着越来越重要的作用。 参考书目：黄留玉，PCR最新技术原理、方法及应用，北京，化学工业出版社，现代生物技术与医药科技出版中心，2005年
聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction）， 聚合酶链式反应简称PCR。聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。编辑本段发展简史人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。 1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。 但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。尔后，Saiki等人又在黄石公园从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学 分析的根本性基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。编辑本段技术原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在 聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。编辑本段工作原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时 聚合酶链式反应间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。编辑本段反应特点特异性强 PCR反应的特异性决定因素为： ①引物与模板DNA特异正确的结合； ②碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。 其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。 对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。编辑本段反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。编辑本段反应体系与反应条件标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板～2ug TaqDNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)编辑本段PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。 ①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 ②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 ③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。编辑本段酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到～，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为～为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。编辑本段工作步骤 PCR反应的基本过程标准的PCR过程分为三步（如图所示）： 变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 2.退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部双链。 3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活 性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延 伸，合成与模板互补的DNA链。 每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。 现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。编辑本段循环参数1、预变性（Initial denaturation）． 模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。 2、引物退火（Primer annealing） 退火温度一般需要凭实验（经验）决定。 退火温度对PCR的特异性有较大影响。 3、引物延伸 引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。 延伸时间随扩增片段长短及所使用Taq酶的扩增效率而定。 4、循环中的变性步骤 循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性： 变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。 5、循环数 大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。 6、最后延伸 在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。 PCR-PCR常见问题编辑本段电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。编辑本段物理原因变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。编辑本段克隆PCR产物1)克隆PCR产物的最优条件是什么？ 最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。 2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？ 如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。 3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？ A）涂布未转化的感受态细胞。 如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。 B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。 例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。 铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为： 1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug 转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞 如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。 C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。 D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。 4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？ A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。 B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。 C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。 D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。 E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞。编辑本段PCR反应的分类SOEing-PCR（重叠PCR）：重叠区扩增基因拼接法，是基于普通PCR 技术衍生出的一种基因融合和定点突变的有效方法。众所周知，由于引物只需要与模板有效结合，尤其是5’端序列不必与模板完全配对，因此扩增引物的5’端可以添加一种甚至是两种酶切位点，以便于后期克隆。SOEing 法正是利用这一特点，向两个独立基因掺入一段新的序列以达到两个基因出现一个重叠区的目的，3’端的结合使基因融合或定点突变得以实现。RT-PCR（逆转录PCR）：RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
一般是抽全血提取外周血单个核细胞（PBMC）提取DNA，（结核分枝杆菌是胞内寄生菌，可存在于白细胞中），然后设计合适的PCR引物直接进行扩增即可。
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PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!
技术的研究进展
摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。
关键词 PCR技术;研究进展;应用
中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02
PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。
1 PCR技术原理
PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。
2 PCR技术的分类
在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。
实时荧光定量PCR技术
1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。
荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。
多重PCR技术
多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。
在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。
单分子PCR技术(SM-PCR)
单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。
单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。
3 PCR技术的应用
PCR技术在水产上的应用
基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。
PCR技术在微生物检测上的应用
1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。
4 展望
传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。
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2007秋西农本科《动物微生物学》课程A卷参考答案与评分标准病毒顽童张德礼2019-10-22 · 西北农林科大教授 清华工学北大医学双博士后西北农林科技大学本科课程考试试卷2007—2008学年第一学期《动物微生物学》课程A卷参考答案与评分标准专业年级： 命题老师： 张德礼 审题老师： 于三科考生姓名： 学号： 考试成绩：一、多项选择题（从A，B，C，D四个答案中选出符合题意的2个或2个以上的正确答案，将其号码填在答题纸上，多选、少选、错选均无分。每小题1分。共5分）1. ABC2. ACD3. ABC4. ABC5. ABC二、填空题（将适合的内容填写在答题纸上。答案填错或未填，该题不得分。每空1分，共5分）1．蓝紫,红2．核酸3.电镜,核衣壳三、判断题（正确的打“√”，错误的打“×”不需要改正，答案写在答题纸上，每小题分，共5分）1. √2. √3. √4. √5. √6. √7. √8. ×9. √10. √四、解释名词（任选5小题，每小题2分，共计10分）1. 病毒包涵体（inclusion body）与DI颗粒包涵体（Inclusion body）：病毒感染细胞后在胞浆或胞核内形成的一种光学显微镜下可见的特殊结构，富含病毒的区域。大多数包涵体由病毒子组成，少数包涵体是细胞对病毒反应的产物。如狂犬病的 Negri 氏体。（1分）或包涵体（Inclusion body）：在病毒感染的细胞内常出现光学显微镜下可见的一种特征的形态学变化，称为包涵体。可能是单个或多个，巨大或细小，圆形或不规则，在核内或胞浆内，嗜酸性或嗜碱性。功能包括：①在包涵体内进行着病毒核酸或蛋白质的合成或病毒子的装配，又叫“病毒工厂”。这种包涵体最常见；②包涵体内含有细胞器。如含有纺锤丝或溶酶体；③包涵体与病毒繁殖没有直接关系。A型包涵体不含病毒子或其产物，B型包涵体存在病毒子或其产物。DI颗粒（缺陷性干扰病毒颗粒）：病毒传代时，如果接种的病毒量很大，在生产的后代中除了少数正常的成熟病毒子外而大量病毒粒子的基因组是不完全的，它们能干扰同源病毒的繁殖叫缺陷性干扰病毒颗粒(DI颗粒)。缺陷病毒本身不能增殖，必须依赖于辅助病毒才能繁殖的病毒叫缺陷病毒,如依赖病毒属只有与腺病毒同感染才能增殖（1分）。2. 干扰现象与干扰素（IFN）干扰现象：一种病毒感染动物机体（或细胞）后能产生抑制其它种病毒感染的作用，称为病毒的干扰现象（1分）。或干扰现象：当两种病毒感染同一细胞，甲种病毒能抑制乙病毒的增殖的现象。干扰素（IFN）：正常动物细胞在某些病毒或适宜诱生剂作用下产生的一种糖蛋白，具有抑制病毒繁殖能力，也能够抵抗肿瘤，促进和调节免疫机能，是机体抵御外来病毒的入侵和维持机体自身稳定的防御物质（1分）。或干扰素是由干扰素诱导剂作用于活细胞后，由细胞产生的一种低分子糖蛋白，能抑制多种病毒的生长和繁殖。或干扰素 是正常细胞在某些病毒或适宜的诱生剂的作用下产生的一种糖蛋白。是机体抵御外来病毒入侵和维持机体自我稳定的防御性物质。3. 无菌动物与无特殊病原菌动物（SPF）无菌动物（germ free animals, GF）：整个机体内不携带任何微生物与寄生虫的动物，即无外源菌动物（axenois aniaml）。获得方法：产前2天剖腹产无菌取出，饲喂于无菌环境中，饮水和饲料严格灭菌，对接触它们的人员或用具也要进行严格消毒和灭菌，营养上满足同类动物需要。实际上某些内源性病毒或正常病毒很难除去，因此无菌动物事实上是一个相对概念。无菌动物中还有一种无丙种球蛋白动物（1分）。或无菌动物（germ free animals, GF）：指正常健康胎儿（或成熟鸡胚）经无菌手术取出后，饲养于特定无任何微生物的环境中，这种不携带任何微生物与寄生虫的动物谓之GF 动物（相对概念：正常健康胎儿——无菌取出——无菌饲喂、管理）。实际上某些内源性病毒或正常病毒很难除去，因此无菌动物事实上是一个相对概念。无菌动物中还有一种无丙种球蛋白动物（1分）。无特殊病原菌（specific pathogen-free animals, SPF）动物：是指不存在某些特定的具有病原性或潜在病原性微生物与寄生虫（病原体）的动物，但非特定的一般微生物和寄生虫是允许存在的。可通过无菌动物与特定病原体以外的正常菌群相联系培育SPF动物（1分）。或SPF动物：指不存在某些特定的具有病原性或潜在病原性微生物的动物（1分）。4. 类病毒与朊病毒类病毒：类病毒(viroid) 是目前已知最小的可传染的致病因子，比普通病毒简单。类病毒是无蛋白质外壳保护的游离的共价闭合环状单链RNA分子，侵入宿主细胞后自我复制，并使宿主致病或死亡。目前关于类病毒的感染和复制机理尚不清楚。朊病毒：朊病毒（prion）与一般病毒不一样，它只有蛋白质而无核酸，但却既有感染性，又有遗传性，并且具有和一切已知传统病原体不同的异常特性。5. 细菌双命名法与病原微生物细菌双命名法：细菌的命名法一般采用林奈氏双命名法，即属名加种名。属名 在前，用拉丁文或拉丁化的名词表示，且第一个字母要大写，种名在后，用拉丁文或拉丁化的形容词或名词所有格表示，第一个字母小写。中文译名与此相反，种名 在前，属名在后（1分）。病原微生物：可以侵犯机体引起感染甚至传染病的微生物，称为病原微生物，或称病原体。病原体中以病毒和细菌的危害性最大。病原体侵入机体后，机体就是病原体生存的场所，我们称为病原体的宿主，病原体在宿主中进行生长繁殖、释放毒性物质等引起机体不同程度的病理变化，这一过程称为感染。病原体入侵机体后，在发生感染的同时，能激发机体免疫系统产生一系列免疫应答与之对抗，这称之为免疫。感染和免疫是一对矛盾，其结局如何，根据病原体和宿主两方面力量强弱而定（1分）。6. 脓毒败血症与毒血症脓毒败血症：细菌进入血流不仅存在血流中同时大量繁殖并引起病理变化为败血症，细菌进入血流后大量繁殖在形成败血症的基础上又转移到多数组织和器官并形成化脓性病灶为脓毒败血症。或脓毒败血症：细菌入血繁殖致机体损伤中毒为败血症，化脓性细菌引起败血症并致脏器化脓为脓毒败血症。毒血症: 指细菌不入血，毒素进入血流或淋巴液中使机体引起中毒。7. 噬菌体与霉形体噬菌体(bacteriophage)：是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称。噬菌体具有病毒的一些特性：个体微小。噬菌体基因组含有许多个基因，但所有已知的噬菌体都是细菌细胞中利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基酸和能量产生系统来实现其自身的生长和增殖。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。霉形体：霉形体以前称支原体（mycoplast），为目前发现的最小的最简单的细胞，也是唯一一种没有细胞壁的原核细胞。霉形体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体。五、英译汉（每题2分，共计20分）1. 病毒感染的宿主细胞应答。分子病毒学与病毒病。抗病毒药物治疗。病毒感染的高速公路。基于模式识别受体的病毒信号通路。用于基因治疗的工程靶向病毒载体。2. 病毒感染与免疫。感染是外源生物侵袭宿主的克隆性有害增殖。免疫（医学意义上的），就是有足够的生物防御能力，可避免感染、疾病或其他生物入侵的一种状态，也可与肿瘤相关。免疫系统就是某种生物通过识别和杀死病原体及肿瘤细胞而抵抗疾病发生的各种机制的集合。3. 监测马立克氏病毒毒力的进化；毒力是病原体突破宿主防御体系，从而导致严重发病或死亡的能力。监测马立克氏病毒毒力的进化具有重要性，并且需要在世界不同地区都进行监测。4. 新方法使马立克氏病毒毒力进化的监测目标更容易达到：发现下一个毒力增强的浪潮；获得强毒株评价疫苗；实验室间数据的标准化。5. 用生物信息学的方法来挖掘源自基因组学的有价值信息。生物信息学和计算生物学对于弄通数据的含义是必需的，而且系统生物学对于理解宿主和病原体之间相互作用的复杂性也是必需的。6. 很多微生物的基因组已被测序，几年内更多微生物的基因组序列将被测定。下一代测序技术，和蛋白质组学及代谢组学技术的采用将会得到大量数据，模拟和建模应当成为实验生物学的整合工具。7. 仅凭一种微生物与某种疾病相关并不能断定该微生物引起该病。那我们如何知道人类免疫缺陷病毒引起艾滋病呢？有一系列规则一直用来鉴定一种微生物引起特定疾病。19世纪晚期德国外科医生罗伯特. 科赫提出了这些规则，也就是现在著名的科赫规则。8. 科赫规则：首先，微生物必须出现在每例疾病中，而在健康动物中不出现；第二，该微生物必须获得分离并在纯培养物中增殖，第三，用该纯培养物感染健康宿主时，能导致相同的病症；第四，必须从被感染宿主中再次分离出该微生物。9. 科赫用该法则证明炭疽杆菌是炭疽的病原菌，炭疽是19世纪70年代欧洲羊群流行的一种致死性疾病。科赫后来用该法则鉴定出现在称为结核分枝杆菌的一种细菌是人类肺结核的致病因子；科赫因研究证明炭疽和肺结核的病原而获得诺贝尔奖。10. 分子科赫法则：首先，在研毒力性状应当更多与微生物致病株相关，而不是与非致病株相关；第二，去除与毒力相关的基因，则病原微生物毒力被减弱或消除；第三，正常野生型基因取代突变基因后，病原微生物应当完全恢复致病性；第四，病原微生物毒力基因在宿主感染发病过程中应当表达；第五；针对病原微生物毒力基因产物的抗体或免疫系统细胞应当能保护宿主。六、简答题（任选3题，每题5分，共15分）1．病毒的基本特征是什么？（5分）答. 病毒的基本特征包括：1、 极其微小(nm), 可通过细菌滤器，借助电镜(EM)才能见到2、 无细胞结构，只有蛋白质和核酸。只有一种核酸，DNA或RNA：天花病毒只有DNA，禽流感病毒只有RNA3、 无产能酶系和蛋白质合成系统，只能借助宿主细胞的功能在活细胞内进行增殖：培养病毒用细胞、动物和鸡胚。专性细胞内寄生，离开细胞以无生命的化学大分子状态存在，也可形成结晶，长期具备侵染力4、 病毒不存在长大过程，只能是各种成分复制，装配成子代病毒：同一种病毒粒子大小基本相同5、 对抗生素不敏感，对干扰素敏感：使用抗生素治疗流感无效，干扰素可以在一定程度上治疗病毒性肝炎6、 有些病毒核酸可以整合到宿主细胞染色体中，造成潜伏性感染：人的鼻咽癌，鸡的马立克等2．病毒进化的特征是什么？（5分）答. 病毒进化的特征包括：1、 新病毒不断产生，基本上从另一种宿主的病毒演化而来2、 新病毒产生后，在新宿主体内分化变异速度快3、 新病毒稳定后，其毒力大多在中等水平4、 病毒进化有一定随机性，又受选择压力而呈一定的方向性和稳定性5、 病毒各基因在进化上具有不同的进化特征3．病毒学研究的重要性体现在哪几方面？ （5分）答. 病毒学研究的重要性体现在以下四个方面：1. 由病毒引起的传染病占75%～80%，急性传染病中的绝大多数为病毒性传染病。2. 病毒病迄今没有有效的治疗方法。3. 病毒是真核细胞基因工程（重组疫苗或基因治疗）和分子生物学研究的有力工具。4. 病毒持续性感染是大问题，并可能转化机体引起恶性肿瘤。4．增强毒力与减弱毒力的方法有哪些?（5分）答. 增强毒力的方法（1分）：1. 连续通过易感动物2. 和其他微生物共生或被温和噬菌体感染。例如魏氏梭菌与八叠球菌共生时毒力变强，无毒的白喉棒状杆菌被温和β-噬菌体感染后产生白喉毒素，成为有毒细菌。3. 实验动物腹腔内放置胶囊病原菌。减弱毒力的方法（2分）：1．通过非易感动物例如：马尔他强毒布氏杆菌连续通过鸡育成弱毒株；猪丹毒苗GC42系将强毒株通过豚鼠传370代后又通过鸡传42代育成弱毒。2．在较高温度下培养强毒炭疽 ——℃下培养——弱毒3．在含有某些特殊化学物质的培养基中培养法国学者卡-介二氏将有毒的牛型结核杆菌菌株 ——在含胆汁的甘油马铃薯培养基中培养——13年传230代（15天/每代）——而获得的一株毒性低而抗原性完整的变异菌株, 可作成活疫苗给人接种以预防结核病。即著名的卡介苗BCG4．在含有抗血清、噬菌体或抗生素的培养基中培养5．长期的人工培养6．在特殊气体条件下培养如无荚膜炭疽芽胞苗是半强毒株在含50%血清的培养基上，在50% CO2的条件下选育的7．通过基因工程的方法去除毒力基因可获得无毒力株5． 细菌的特殊构造及其功能有哪些？写出3种动物病原细菌及所致传染病名称。 （5分）答. 细菌的特殊构造包括荚膜、鞭毛、纤毛（或线毛、菌毛、伞毛）和芽孢等。荚膜可保护细胞，抗干燥；贮藏养料，是细胞外碳源和能源的储备物质；荚膜可以抵御外界细胞对菌体的吞噬作用；荚膜具有抗原性；与致病力有关（分）。鞭毛具有运动功能（分）。纤毛（或线毛、菌毛、伞毛）不具有运动功能，但与菌的致病性．吸附等有关（分）。芽孢是对不良环境有较强抵抗力的休眠体（分）。呼肠孤病毒科草鱼出血病病毒引起草鱼出血病（1分）；疱疹病毒科鲤疱疹病毒引起鲤痘疮病（1分）；鳃霉菌引起鳃霉病（1分）。6． 请说明细菌革兰氏染色原理、方法和结果判定标准。（5分）答. 革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。革兰氏染色原理（2分）：第一步：结晶紫使菌体着上紫色第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻留在细胞内。第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。基本步骤（2分）：涂片固定—— 结晶紫初染1min—— 碘液媒染1min——95%乙醇脱色—— 番红复染min结果（1分）:革兰氏阳性菌——兰紫色；革兰氏阴性菌——红色。七、论述题（1题必答，2和3题任选其一，每题20分，共40分）1．试述病毒复制的一般过程（尽可能详细,必要时举例说明）。（20分）病毒的复制周期：病毒吸附易感细胞，进入细胞后，将其核酸释放到细胞内，以病毒核酸为模板，在病毒和/或细胞酶作用下，分别合成病毒核酸和蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒，这个过程称为病毒的复制周期。病毒的复制过程：一般分为吸附、脱壳、穿入、生物合成、成熟和释放连续过程。（1）吸附（3分）是决定感染成功与否的关键环节。需要病毒表面特异性的吸附蛋白（Virus attachment Protein, VAP）与细胞表面受体（也称为病毒受体，virus receptor）相互作用。大部分动物病毒的病毒受体为镶嵌在细胞膜脂质双分子层中的糖蛋白，也有的是糖脂或唾液酸寡糖苷。在0-37℃内温度越高病毒吸附效率也越高，整个过程可在几分钟到几十分钟的时间内完成。 病毒的细胞受体具有种系和组织特异性，决定了病毒的宿主谱。不同种属甚至同种不同型以及同型不同株的病毒，其细胞受体也不相同。而有些不同种属的病毒却有相同的细胞受体，其吸附和感染可对其它病毒的感染产生干扰。（2）侵入 （3分）病毒通过以下不同的方式进入宿主细胞：注射式侵入、细胞内吞、膜融合以及其他特殊的侵入方式。注射式侵入：一般为有尾噬菌体的侵入方式。通过尾部收缩将衣壳内的DNA基因组注入宿主细胞内。细胞内吞：动物病毒的常见侵入方式。经细胞膜内陷形成吞噬泡，使病毒粒子进入细胞质中。膜融合：有包膜病毒侵入过程中病毒包膜与细胞膜融合。（3）脱壳（3分）病毒感染性核酸从衣壳内释放出来的过程。有包膜病毒脱壳包括脱包膜和脱衣壳两个步骤。无包膜病毒只需脱衣壳，方式随不同病毒而异。注射式侵入的噬菌体和某些直接侵入的病毒可以直接在细胞膜或细胞壁表面同步完成侵入和脱壳。病毒粒子以内吞方式或直接进入细胞后，经蛋白酶的降解，先后脱去包膜和衣壳。以膜融合方式侵入的病毒，其包膜在与细胞膜融合时即已脱掉，核衣壳被移至脱壳部位并在酶的作用下进一步脱壳，病毒核酸游离并进至细胞的一定部位进行生物合成。病毒脱壳必须有酶的参与，脱壳酶来自宿主细胞，有的为病毒基因编码。（4）生物合成 （3分）借助宿主细胞提供的原料、能量和场所合成核酸和蛋白质，期间所需的多数酶也来自宿主细胞。在病毒进入宿主细胞后生物合成阶段，胞浆中无病毒颗粒，称为隐蔽期（eclipse）。具体生物合成以逆转录病毒为例附后。（5）装配（3分）病毒的结构成分核酸与蛋白质分别合成后，在细胞核内或细胞质内组装成核衣壳。绝大多数DNA病毒在细胞核内组装，RNA病毒与痘病毒类则在细胞质内组装。无包膜病毒组装成核衣壳即为成熟的病毒体，病毒的早期蛋白，即非病毒结构成分不组装入病毒，残留在感染细胞中。（6）释放 （3分）绝大多数无包膜病毒释放时被感染的细胞崩解，释放出病毒颗粒，宿主细胞膜破坏，细胞迅即死亡。绝大多数有包膜病毒通过细胞内的内质网、空泡，或细胞核膜或细胞膜以出芽方式释放而成为成熟病毒，在一段时间内逐个释出，对细胞膜破坏轻，宿主细胞死亡慢。从单个病毒吸附开始至所有病毒释放，此过程称为感染周期或复制周期。一个感染细胞一般释放的病毒数约为100-1000。以反转录病毒为例，生活周期大致过程如下（2分，每点分）：(1) 吸附：病毒粒子表面的囊膜与细胞表面的病毒受体结合而吸附在细胞表面；(2) 穿入：病毒核心进入细胞浆；(3) 反转录：在病毒核心复合体中，RNA反转录产生DNA；(4) 转运：DNA转运至细胞核中；(5) 整合：病毒DNA整合于细胞染色体；(6) 转录：整合的前病毒DNA，借助于细胞的RNA聚合酶Ⅱ，转录生成病毒RNA；(7) 加工转录产物：转录产物被加工成基因组RNA和指导蛋白质合成的mRNA；(8) 合成病毒蛋白：合成Gag蛋白、PR蛋白、Pol蛋白、Env蛋白等；(9) 病毒粒子装配和出芽释放；(10) 衣壳蛋白进一步加工，成为成熟的病毒粒子2．试述病毒分离培养、鉴定与特异性诊断的一般程序。（20分）（一）病料采集、运输与保存（3分）根据流行病学情况及临床特征初步怀疑疾病种类，有目的采用。1．采集：①主要病变组织：水泡液，痘痂皮，肝，脾，流产胎儿，法氏囊，关节液，脑，鼻液，气管渗出物等；②高热期血液（肝素抗凝，不能用枸椽酸Na），血清；③死亡动物尸体2．运送：低温下运送（冰壶、液N2罐）3．保存：低温下保存（-40℃、-70℃）（二）病料的处理（3分）1．血清：不需处理（-40℃保存）2．组织病料：称重、剪碎→加1∶5～1∶10无菌生理盐水稀释→研磨→冻融3次（-40℃）→1500～2000rpm离心15min → 上清+双抗（青链霉素500μ/ml）→4℃过夜→-20℃保存备用。或者上清滤过除菌（μM滤膜）→滤液-20℃保存备用。三、病毒的分离培养（6分）1．本属动物或实验动物接种2．鸡胚接种：尿囊膜接种：9-10日龄鸡胚 IBDV尿囊腔接种：9-10日龄鸡胚 NDV，AIV（禽流感）卵黄囊接种：6日龄鸡胚 兰舌病鸭胚接种尿囊腔： EDS-76（减蛋综合症）3．细胞培养：①原代细胞（多用于实验室）；②二倍体细胞（多用于大规模生产）；③传代细胞系（多用于大规模生产）培养，具体方法包括静置培养、旋转培养、悬浮培养（多用于不粘壁细胞）和微载体培养（使细胞粘于微载体）等4．细胞病变效应（CPE）CPE：病毒感染细胞后引起的不同细胞病变效应。对某种病毒来讲，CPE特征固定不变。另外，还有一些病毒感染细胞不产生CPE（猪瘟病毒），可以作为病毒鉴定标志。（四）分离物的鉴定（6分）1．形态学鉴定：电镜负染、电镜超薄切片及扫描电镜观察等；2． 核酸类型：5－（溴，碘）氟尿嘧啶，DNA病毒敏感，RNA病毒不受影响；嘧啶橙染色：双链呈黄绿色，单链呈大红色；3．理化学鉴定：耐酸、耐热、耐乙醚和氯仿、病毒大小测定、病毒浮密度等。每种测定方法均以病毒TCID50测定作为基础。如对的敏感性（鼻病毒、口蹄疫病毒对敏感，猪水泡病毒不敏感），在Mg2+存在下的耐热性（肠道病毒耐热，其它微RNA病毒不耐热），有无囊膜鉴定的乙醚或氯仿敏感试验等；4．生物学特性鉴定：耐胰蛋白酶试验、血凝性（有无血凝素）和血吸附特性等；5．免疫血清学鉴定：血清中和试验（动物、鸡胚、细胞等）、荧光抗体染色、免疫组化法、其他血清学试验（血凝抑制试验、血吸附试验 ，补体结合试验 ，荧光抗体试验 、ELISA、免疫扩散试验 ，对流电泳试验）等 ；6．分子生物学鉴定：用SDS-PAGE进行病毒多肽性分析，用琼脂糖凝胶电泳进行核酸节段鉴定，PCR或RT-PCR、核酸杂交、序列分析、病毒蛋白特性分析等。（五）特异性诊断（2分）：根据以上实验结果，结合流行病学调查资料、临床症状观察及病理学特征分析一般可给出特异性诊断结论。3．以采集猪流产胎儿胃内容物病料为例系统叙述大肠杆菌病与沙门氏菌病的鉴别诊断？（20分）一、取材：取猪流产胎儿瘤胃内容物，染色涂片二、镜检：均为G－中等大小杆菌，能运动，无芽胞，无荚膜（大肠杆菌常有微荚膜）三、分离培养，观察培养特性：培养基大肠杆菌沙门氏菌普通培养基生长良好，37℃ 24h 形成圆形，光滑，隆起，湿润，半透明灰白色菌落形成圆形、光滑、湿润、半透明灰白色菌落普通肉汤均匀浑浊，管底有粘性沉淀，管壁有菌环基本同大肠杆菌血平板β溶血无溶血麦康凯琼脂红色菌落无色菌落伊红美蓝琼脂黑色带金属闪光的菌落无色菌落远藤氏琼脂带金属光泽的红色菌落无色菌落SS琼脂红色小菌落无色菌落三糖铁（TSI）斜面黄色，底部黄色，不产生H2S斜面红色，底部黄色，若有H2S产生，底部为黑色四、观察生化特性：项目大肠杆菌沙门氏菌葡萄糖⊕⊕乳 糖⊕－麦芽糖⊕⊕蔗 糖⊕－靛基质实验（I）+－甲基红试验（MR）++乙酰甲基醇（VP）－－柠檬酸基利用试验（C）－+五、血清型鉴定：大肠杆菌：大肠杆菌血清型较多，引起致病的大肠杆菌，主要有30多个血清型，如O85、O19、O16、O128、O18、O26、O86、K88、K99等，可用血清凝集试验或全血平板凝集试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法进行检查。沙门氏菌：①分群：取一张洁净玻片，取2满杯沙门氏菌多价O血清（A-F群）至玻片上，再挑取沙门氏菌纯培养物与多价O血清混匀，2min内凝集者可初步确定为沙门氏菌。同时设立空白对照。再用代表A群（A群中都含有O2血清），B（O4），C1（O7），C2（O8）D（O9），E（O3）的O因子血清作同样玻板凝集反应，视其被哪一群O因子血清所凝集，则确定被检菌为该群。②定型：菌群确定后，用该群所含的各种O因子血清与被检菌作玻板凝集反应，以确定其含有哪些O抗原，同样用该群中H因子血清与被检菌作玻片凝集反应，以确定H抗原。据O和H抗原查沙门氏菌抗原表可检出为哪种沙门氏菌。搜索病原微生物题库及答案临床生物化学检验课件微生物学记忆口诀动物细胞融合的原理西农的985被社会承认吗靛蓝诺卡氏菌分布区域
对不起因为我不是兽医所以也不太知道。下面这些是我在网上找的，我感觉挺全，希望可以帮到你。畜共患传染病：1 炭疽 2 大肠杆菌病 3 沙门氏菌病 4 巴氏杆菌病 5 布鲁氏菌病 6 结核病 7破伤风 8弯曲菌病 9李氏杆菌病 10肉毒梭菌毒素中毒症 11链球菌病 12钩端螺旋体病 13衣原体病 14皮肤真菌病 15附红细胞体病 16痘病 17口蹄疫 18狂犬病 19流行性乙型脑炎 20流行性感冒 21轮状病毒感染 猪传的染病：1猪丹毒 2猪梭菌性肠炎 3猪痢疾 4猪支原体肺炎 5猪接触传染性胸膜肺炎 6猪传染性萎缩性鼻炎 7猪瘟 8非洲猪瘟 9猪细小病毒感染 10猪繁殖和呼吸综合征 11猪传染性胃肠炎 12猪流行性腹泻 13猪水疱病 14猪伪狂犬病 15猪圆环病毒感染 家禽的传染病：1鸡败血霉形体感染 2传染性鼻炎 3鸭传染性浆膜炎 4鸡葡萄球菌病 5绿脓杆菌感染 6禽曲霉菌病 7新城疫 8传染性喉气管炎 9禽传染性支气管炎 10禽白血病 11马立克氏病 12传染性法氏囊病 13禽呼肠孤病毒感染 14禽脑脊髓炎 15禽腺病毒感染 16鸭瘟 17鸭病毒性肝炎 18小鹅瘟 19番鸭细小病毒病 20鸡传染性贫血 21禽网状内皮组织增殖症 22多病因呼吸道病 反刍动物传染病：1气肿疽 2副结核病 3传染性角膜结膜炎 4牛传染性胸膜肺炎 5牛放线菌病 6无浆体病 7牛瘟 8恶性卡他热 9牛病毒性腹泻一黏膜病 10牛流行热11染性鼻气管炎 12牛白血病 13羊梭菌性疾病 14蓝舌病 15梅迪一维斯纳病 16羊传染性脓疱 17牛海绵状脑病 18绵羊痒病 19小反刍兽疫 20绵羊肺腺瘤病马的传染病：1鼻疽 2类鼻疽 3马传染性子宫炎 4马传染性贫血 5马传染性鼻肺炎 6马传染性脑脊髓炎 7非洲马瘟 8流行性淋巴管炎
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基因是DNA分子上的一个功能片段，是遗传信息的基本单位，是决定一切生物物种最基本的因子;下面是我整理了基因检测技术论文，有兴趣的亲可以来阅读一下!
病毒基因的检测
【关键词】 病毒基因 检测
一 乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)测定
乙型肝炎是由乙肝病毒引起的以肝脏损害为主要临床特征的急、慢性传染病，严重者可 发展成慢性肝炎、肝硬化和肝癌。在我国，乙肝是危害人类健康的一种主要传染病。
【 参考值】
阴性 (Taqman荧光定量PCR技术)
【临床意义】
是乙型肝炎病毒感染的直接证据，是HBV有活性复制能力及具传染性的确切标志。
2.可定量检测HBV-DNA含量，为临床病情判断、疗效观察提供信息。
的出现先于其他血清学指标(如HBsAg)，可早期诊断HBV感染。
4.正常人HBV-DNA为阴性。当HBV-DNA为101～104拷贝/ml时，表明病毒复制水平低，传染性较弱;而当 HBV-DNA>104拷贝/ml时，表明病毒复制水平高，传染性强。
含量测定可为临床药物选择提供依据。
【注意事项】
1.标本可用血清或血浆，避免肝素抗凝，避免反复冻融。
2.标本室温放置不超过4小时。
3.溶血、高胆红素标本影响检测结果。
二 其他病毒DNA测定
(一)人乳头瘤病毒DNA(HPV-DNA)检查
人乳头瘤病毒是一种小的双链DNA病毒，根据核酸相关性分型已发现70余型。该病毒可以感染人的皮肤和黏摸上皮细胞，诱发细胞增生，产生乳头瘤样病变。
【参考值】
阴性 (多重核酸荧光定量PCR技术)
【临床意义】
难以用传统的病毒培养及血清学技术检测，目前主要采用分子生物技术检测HPV-DNA，灵敏度高。
2.可对尿道、阴道、宫颈脱落细胞进行人乳头瘤病毒的检测及分型，判断体内HPV感染状况。
6和11型与尖锐湿疣、喉头鳞状上皮乳头状瘤发生有关;HPV 16、18、31、32型等与宫颈癌发生相关。因此，可用于对HPV高危亚型的诊断，对尖锐湿疣、宫颈癌等疾病的诊断与筛查具有重要意义。
检测可用于考核疗效与预后。
【注意事项】
1.用无菌拭子取尿道、阴道、宫颈分泌物于无菌试管或无菌瓶中。
2.标本采集应严格按无菌操作，避免污染。并及时送检。
(二)人类巨细胞病毒DNA(HCMV-DNA)检查
HCMV是疱疹病毒科成员，人类普遍易感，多为隐性或潜伏感染。在免疫功能低下、缺陷或抑制情况下，可发生成人HCMV感染，常呈弥漫性病变，严重者甚至死亡。
【参考值】
阴性 (荧光探针杂交PCR技术)
【临床意义】
1.用于临床HCMV感染的快速诊断。
2.用于临床免疫抑制 治疗过程中体内HCMV感染的快速诊断与疗效监测。获得性免疫缺陷综合征等患者HCMV感染的诊断与疗效监测。
技术检测HCMV的敏感性高，且HCMV-DNA的出现早于临床症状或血清学标记物的出现，可早期诊断 HCMV感染。
4.妊娠早期感染HCMV可引起胎儿先天畸形，产前检测HCMV-DNA有利于优生优育。
5.连续监测巨细胞病毒的含量变化可了解病毒的复制状况，从而为疾病的早期诊断与药物疗效提供直接的病原学依据。
【注意事项】
采用EDTA抗凝全血或脑脊液标本，采集后及时送检。
(三)单纯疱疹病毒DNA(simplex herpes virus， HSV-DNA)
单纯疱疹病毒是一种有囊膜的双股DNA病毒，分为I型和II型。近年来，HSV是性传播疾病、病毒性脑炎等疾病的重要病原体。
【参考值】
阴性 (荧光探针PCR技术)
【临床意义】
1.用于检测人血清样本或体液样本中的单纯疱疹病毒并可同时分型，辅助诊断HSV感染性疾病。
I型感染主要引起口唇疱疹、疱疹性结膜炎、脑炎和皮肤性疱疹，HSV II型主要引起生殖器疱疹， HSV-DNA检测可辅助诊断上述疾病，并可用于考核疗效与预后。 【注意事项】
1.血清用无菌注射针头抽取静脉血2ml于无菌肝功管中。
2.分泌物用无菌棉拭子采集标本，女性取宫颈或阴道分泌物，男性取精液或前列腺液，将取样后的棉拭子放入无菌试管或无菌瓶中。
3.脑脊液抽取脑脊液于无菌玻璃瓶中。
(四)EB病毒DNA(EB virus，EBV-DNA)
EBV属于丫疱疹病毒科，主要经涎液传播，PCR技术可灵敏地检测出标本中的EBV-DNA，满足临床诊断、 治疗需要。
【 参考值】
阴性 (荧光探针杂交PCR技术)
【临床意义】
1.可快速检测血液、脑脊液、组织、尿液中的EB病毒，为EB病毒感染提供直接证据。
病毒临床上与鼻咽癌传染性单核细胞增多症、霍奇金病等的发病密切相关。
【注意事项】
1.检测标本可采用EDTA抗凝全血、脑脊液、咽拭子、尿液、病变组织等。
2.标本采集时严格按无菌操作，并及时送检。
三 RNA病毒测定
丙型肝炎病毒RNA(HCV-RNA)检测
丙型肝炎病毒是一种单链正股RNA病毒，引起丙型病毒性肝炎。丙型病毒性肝炎多因输血或血制品而引起，在输血者中还存在无症状的HCV携带者。
【参考值】
阴性(RT-PCR，荧光定量PCR技术)
【临床意义】
1.有助于HCV感染的早期诊断。
阳性提示HCV复制活跃，传染性强。
转阴提示HCV复制受抑，预后较好。
4.连续观察HCV-RNA，结合抗-HCV的动态变化，可作为丙肝的预后判断和干扰素等药物疗效的评价指标。
【注意事项】
1.标本可用血清或血浆，用无菌注射针头抽取静脉血2～3ml于无菌肝功管或EDTA抗凝管中送检。避免肝素抗凝，避免反复冻融。
2.标本室温放置不超过4小时。
3.溶血、高胆红素标本影响检测结果。
参 考 文 献
[1]杨振,祁自柏,李河民.病毒基因检测技术的 发展趋势. 《 中国生物制品学杂志》,2006年01期.
[2]徐丽.利用基因工程进行PHB相关基因的克隆和烟草转化[D].山东师范大学,2000年.
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PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。下面是我整理的关于pcr技术论文，希望你能从中得到感悟!
技术的研究进展
摘要 PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，已被广泛地应用于水产、微生物检测等许多领域。该文从PCR技术的原理及应用方面进行了综述，并对其发展做出了展望。
关键词 PCR技术;研究进展;应用
中图分类号 Q819 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2012)10-0047-02
PCR(polymerase chain reaction，PCR)即聚合酶链式反应，它是一种体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年，美国Karray等学者首创了PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2-3]。随着PCR技术的不断发展，在常规PCR技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR(mutiplex PCR)技术[4]、实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)技术[5]、单分子PCR技术[6]。
1 PCR技术原理
PCR技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列(模板)在酶促作用下进行扩增。PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94 ℃的条件下变性解链;第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55 ℃退火;第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[7]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数级方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00万~200万倍[1]。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。
2 PCR技术的分类
在传统PCR技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。
实时荧光定量PCR技术
1996年，学者经过研究，在传统PCR技术的基础上，首创了实时荧光定量PCR技术，新技术已经应用至医学领域、分子生物学和其他基础研究领域。实时荧光定量PCR技术基于传统技术的优势，还具有实时性、准确性、无污染，实现了自动化操作和多重反应，是PCR技术研究史上从定性到定量的飞跃[8]。
荧光定量PCR技术最大的特点是能将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助于荧光信号，累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析[9]。实时监测这一特点是常规PCR技术所不具有的，因为其对扩增反应不能进行随时的检测。常规PCR技术的扩增终产物需要在凝胶电泳等条件下才能进行，无法对起始模板进行准确的定量，而荧光定量PCR技术的反应进程可以根据荧光信号的变化做出准确的判断[10-11]。一个PCR循环反应结束之后，定量PCR仪可以收集1个荧光强度信号，荧光信号强度的变化可以反映产物量的变化情况，这样就可以得到1条荧光扩增曲线[12]。荧光信号在指数扩增阶段，PCR产物荧光信号的对数值与起始模板量之间存在线性对应关系，然后进行定量分析[13]。
多重PCR技术
多重PCR(mutiplex PCR)技术是PCR技术的一种，为同一管中加入多对特异性引物，与PCR管内的多个模板反应，在一个PCR管中同时检测多个目标DNA分子。多重PCR技术可以扩增一个物种的一个片段，也可以同时扩增多个物种的不同片段[14]。
在同一反应体系中，多重PCR技术进行多个位点的特异性扩增时，引物间的配对、引物间的竞争性扩增等会对扩增效果产生重要影响。一方面，如果能选择适宜的反应体系和反应条件，可极大地提高多重PCR的扩增效果[15]。主要包括退火温度、退火及延伸时间、PCR缓冲液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等。另一方面，DNA的抽提质量也影响多重PCR扩增效率，如DNA抽提不干净或降解都将影响PCR扩增效果[16]。
单分子PCR技术(SM-PCR)
单分子PCR技术是在传统PCR技术的基础上发展的，基本循环过程相同，但在反应条件、模板数量、DNA 聚合酶选择、引物设计方面具有不同点。该技术是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR[17]。
单分子PCR技术反应中，DNA 模板浓度极低，这就要求模板有较高的质量。因为这是试验成败的决定性因素。在设计引物时，应该严格控制GC的含量和Tm值，同时尽量避免引物间存在可配对序列。在反应混合物模板数极低的情况下，若引物之间存在少量配对序列，扩增时极易形成二聚体，使反应无法进行，得不到所需要的产物[18]。由于单分子PCR技术反应的变性温度(96~98 ℃)大多比常规PCR技术(94 ℃)略高，因而对DNA 聚合酶热稳定性的要求也更加严格，需要有较好的热稳定性，以防止温度过高而使其失活。其变性时间(5~15 s)、退火时间及延伸时间也短于常规PCR技术[17]。
3 PCR技术的应用
PCR技术在水产上的应用
基因表达是检测某个基因在不同发育期或不同组织中的表达量变化，或受到某种试验处理过程中的影响而出现表达量变化的情况。有学者应用real-time PCR技术研究碳水化合物含量对翘嘴红鲴糖代谢酶G6Pase、GK以及PEPCK表达量的影响[19-21]，研究结果可为翘嘴红鲴饲料配方中的最合适糖含量提供理论依据。孙淑娜等[22]研究叶酸拮抗剂对斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2表达的影响，表明叶酸拮抗剂对早期胚胎的心脏发育影响较大，可导致斑马鱼心脏发育延迟及心脏形态异常，并下调斑马鱼心脏发育相关基因BMP2b及HAS2的表达，这可能是叶酸生物学活性受抑后导致心脏发育异常的机制之一。Sawyer et al[23]以斑马鱼的未受精卵、胚胎、仔鱼和成鱼为研究材料，采用实时荧光定量PCR技术，检测了P450aromA和P450aromB在不同组织的表达量，表明在各组织中均有2种基因的表达，但表达量显著不同，呈现组织特异性。
PCR技术在微生物检测上的应用
1990年，Bej et al[24]在利用多重PCR的方法检测了Leg-ionella类菌种和大肠类细菌，其结果是通过点对点方法固定的多聚dT尾捕捉探针和生物素标记的扩增DNA进行杂交来检测的。张志东等检测口蹄疫病毒(FMDV)持续性感染的带毒动物，表明实时荧光定量PCR技术具有快速检测、准确、客观等优势，较优于传统的检测方法[25-26]。Metzger-Boddien et al[27]对PCR-ELISA的方法进行了评价，结果显示，样品中沙门氏菌的检出率可以达到98%。
4 展望
传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来，已被广泛应用到生命科学的各个领域。随着技术方法的不断改进与完善，荧光定量PCR技术将会逐渐完善并广泛应用。多重PCR技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中具有重要作用;未来的研究主要集中在去除食品抑制因子干扰、改进样品前处理技术等方面，其次是整合应用多重PCR与其他技术，必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景。
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医学类学术期刊有：
一、中华医学杂志
《中华医学杂志》是1915年创办的双语学术期刊，周刊，中国科学技术协会主管，中华医学会主办。期刊主要反映中国医学最新的科研成果，积极推广医药卫生领域的新技术、新成果，及时交流防病治病的新经验。
期刊主要反映中国医学最新的科研成果，积极推广医药卫生领域的新技术、新成果，及时交流防病治病的新经验。期刊主要读者对象是广大医药卫生人员。
二、第四军医大学学报
《医学争鸣》刊载的内容主要是医学学术方面的各种看法和观点的交锋与辩论。英文刊名为《NEGATIVE》，以期经历“否定—否定之否定—肯定”的螺旋式上升，达到新的认识境界。
反映发明与创新、否定与假说、探索与发现等前沿医学思想，传播医学领域新观点、新方法和新成就，服务医学科学研究和我国卫生事业发展。。
三、第三军医大学学报
《第三军医大学学报》（Journal of Third Military Medical University）是由中国人民解放军陆军军医大学（第三军医大学）主管、主办中文版半月刊。
据2018年4月《第三军医大学学报》编辑部官网显示，《第三军医大学学报》第十届编辑委员会拥有常务委员49人，委员127人，特约编委5人，海外编委12人。 据2018年4月中国知网显示，《第三军医大学学报》共出版文献18690篇，总被下载1789818次、总被引87645次。
四、第二军医大学学报
《第二军医大学学报》是经中国人民解放军总政治部、国家新闻出版署批准，由第二军医大学主管、主办的综合性医药卫生类学术刊物。1980年6月创刊。
据2018年9月《第二军医大学学报》官网显示，《第二军医大学学报》编委会拥有委员67人，客座编委13人，2017年度共有368位审稿专家。
五、南方医科大学学报
《南方医科大学学报》(原第一军医大学学报)创刊于1981年，为国内外发行的高级综合性医药卫生期刊。是中国百种杰出学术期刊。
被美国Medline/PubMed、美国化学文摘(CA)、荷兰《医学文摘》（EMBASE）、中国科学引文数据库(CSCD)源期刊、中国科技论文统计源数据库、中文核心期刊要目总览(2011年版，北京大学图书馆)等国内外重要数据库收录。
医学核心论文期刊如下：
1、《中国社区医师》国内发行量大的国家级综合性医学期刊、中国知网收录期刊、旬刊。
2、《医学信息》国内发行速度快的国家级综合性医学期刊、中国知网收录期刊、旬刊。
3、《吉林医学》创刊历史久远，综合性医学学术期刊、旬刊、中国知网收录期刊。
4、《中国医药指南》国家级科技期刊、半月刊、中国知网收录期刊。
5、《中国中医药现代远程教育》国家级科技期刊、半月刊、中国知网收录期刊。
6、《内蒙古中医药》综合性学术期刊、旬刊、万方收据库收录期刊，职称晋升认定期刊。
7、《按摩与康复医学》国家级优秀科技期刊、中华中医药学会系列、万方数据库收录、职称晋升认定期刊。
8、《中国卫生产业》国家级医药卫生期刊、月刊、中国核心期刊（遴选）数据库收录期刊。
9、《中国当代医药》国家级医药卫生专业刊物、旬刊、中国知网收录期刊。
10、《中国美容医学》中国科技核心期刊、月刊、中国知网收录期刊。
11、《中国药业》中国科技核心期刊、半月刊、中国知网收录期刊。
12、《临床合理用药杂志》综合性医药卫生类学术期刊、半月刊、中国知网收录期刊。
医学类核心期刊主要包括以下几个方面：