酵素毕业论文参考文献

光合作用的发现 古希腊哲学家亚里士多德认为，植物生长所需的物质全来源于土中。荷兰人范·埃尔蒙做了盆栽柳树称重实验，得出植物的重量主要不是来自土壤而是来自水的推论。他没有认识到空气中的物质参与了有机物的形成。在此前后,中国明末的宋应星在《论气》一书中说:“气从地下催腾一粒，种性小者为蓬，大者为蔽牛干霄之木，此一粒原本几何？其余则皆气所化也。”明确认识到植物(以及动物)身体的物质是由气转化而来。英国J.普里斯特利在1771年发现植物可以恢复因蜡烛燃烧而变“坏”了的空气。1773年荷兰J.英恩豪斯证明只有植物的绿色部分在光下才能起使空气变“好”的作用。1804年瑞士索绪尔通过定量研究进一步证实CO2和水是植物生长的原料。1845年德国.迈尔发现植物把太阳能转化成了化学能。1860年左右，人们就已经用 CO2+H2O→(CH2O)+O2表示植物利用光能的总过程。1897年首次在教科书中称它为光合作用。 20世纪30年代，.范尼尔发现有些细菌可在无氧条件下利用光能进行与光合作用类似的反应。但它们是从硫化氢等而不是从水取得还原二氧化碳的氢，也不释放氧气。他把这个反应称为细菌光合作用。此外，人们还发现有些细菌可通过氧化一些无机物获得能量进行有机物的合成反应,其过程和光合作用有许多类似之处,被称为化能合成作用。 光呼吸的发现 人类早已注意到多种植物的开花时间相对稳定，但光周期在决定开花期方面所起的作用直到20世纪才了解清楚。1912年法国J.图尔努瓦发现大麻，在每日 6小时的短日照条件下会开花，在长日照下则停留于营养生长阶段。1913年德国.克莱布斯发现人工加长每日照光时间，可使通常在6月开花的长春花属(Sem-pervivum) 植物能在冬季开花。但明确地提出光周期理论的是美国园艺学家 .加纳与 .阿拉德。他们在1920年发现，将在美国南部正常开花的烟草（Nicotia-natabacum Mammoth 品种）移至美国北部栽培时，夏季只长叶不开花；但如果在秋冬移入温室则可开花结实。在北方夏季用遮光办法缩短日照时数到每天14小时以下，也可使它开花。以后发现大豆（Biloxi品种）、紫苏、高粱等也有这种现象，并各有其日长上限，日照长度短于此数值时即可开花，称此日长限度为临界日长。同时发现菠菜、萝卜等植物相反，须在日照长度超过一临界日长时才能开花。 细胞的发现 组成动植物身体的大多数细胞才20—30微米，而人眼的分辨率只有100微米。因此，在显微镜发明之前，人们还不可能知道细胞是什么东西。意大利著名科学家伽利略在1610年用自己制作的简单显微镜观察一些小动物。后来荷兰布商列文虎克磨制了一个短焦距透镜，制成了一架简单的显微镜，用来观察池塘水滴，发现了许多水里的微小生物，但这些显微镜很简陋，还看不到生物体内的微细结物。 1665年英国科学家胡克用自己制作的显微镜观察了用锋利小刀切下的一些薄的软木，他看到了木片是由许多蜂窝状小格子组成。他把这一个个小室叫做“细胞”。当时他认为这些小室起着和动物身体中血管类似的作用，在生活时有液体在其中流动，以运送营养。事实上他当时看到的只是已经死亡的植物细胞的细胞壁。但是胡克在《显微图谱》中有关细胞的描写，是人类对细胞的首次观察记录。 细胞世界的大门打开了。但由于当时所用的显微镜都是手工磨制的，化工多、价格贵、质量差，因此从1675—1830年的近150年中，有关细胞的知识几乎没有什么进展。 细胞学说的创立 细胞学说主张生物是由细胞组成的，细胞是生物的基本结构、功能单位和发育基础。细胞学说的形成经过几百年的研究，渐臻完备。16世纪末、17世纪初，显微镜问世后，为探索生物的微观结构提供了有效手段。17世纪中叶，英国人胡克首先观察到植物细胞。同时代的荷兰人列文虎克、意大利人马尔比基也相继看到植物细胞。然而都没有认识到细胞是植物界独立的、活的结构单位。19世纪初，德国植物学家特雷维拉努斯和莫尔阐明细胞是植物的结构单位，称细胞内含物为原生质。 到了19世纪30年代初，布朗观察到植物细胞大都有核。普金叶还观察了鸡胚。莫尔和耐格里提出植物和动物细胞的原生质基本上是一致的，至此，对细胞有了一个基本概念。1838年德国植物学家施莱登在他的“植物发生论”中，提出植物结构的细胞说，他认为细胞是一切植物结构的基本单位，是一切植物借以发展的实体；最简单的植物是由一个细胞构成的，大多数植物是由多个细胞组成的；植物细胞的形成是一个新细胞起源于一个老细胞的核，最初形成老细胞的球体的一个裂片，然后分离出来自成的一个完整的细胞。 1839年德国解剖学教授施旺把施莱登的见解扩大到动物界。他在《关于动植物的结构和生长的一致性的显微研究》论文中提出了动物和植物都是由细胞组成的学说。他认为，有机体的基本部分不管怎样不同，总有一个普遍发育的原则，这个原则便是细胞形成。 施莱登和施旺奠定了细胞学说的基础。细胞学说后来经过许多生物学家补充修改，日趋完善。大体内容是：生物都是由细胞和细胞的产物所构成，所有细胞在结构和组成上是相似的，各自执行特定的功能，并能独立存活，生命过程是有共同性的；生物体通过其细胞的活动，而反映其功能；新细胞是由已存在的细胞一分；为二形成的，各种细胞有它发生、发展过程；生物病害是其细胞新陈代谢和代谢失常所致。

药学毕业论文开题报告篇3 题 目 名 称： 番泻叶对小鼠尿量的影响 研究现状： 一、普鲁兰酶 普鲁兰酶(Pullulanase，. 2. 1. 41)是一种能够专一性切开支链淀粉分支点中的α糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉的脱支酶。普鲁兰酶还可以分解普鲁兰多糖，普鲁兰酶来源于微生物，R-酶则来源于植物。普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气气杆菌Aerobacter. aerogenes}(典型菌为肺炎克雷伯氏杆)发酵获得，他们报道了该酶良好的酶学性能。之后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区、微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。 在淀粉加工工业中，α淀粉酶最为常用，它的功能是水解淀粉的α-1,4糖苷键，单独用它时，产物中含有大量分支结构的糊精，其中就含有大量的α-1,6糖苷键。假如不把淀粉的α-1,6糖苷键彻底分解的话，势必会造成很大的浪费。自然界中，存在有能分解淀粉的α-1,6糖苷键的酶，通称为解支酶。如寡α-1,6葡萄糖苷酶( , Oligo-l,6-glucosidase )，普鲁兰酶( )，异淀粉酶( , Isoamylose )，支链淀粉一6-葡聚糖酶( )，其中普鲁兰酶要求的底物分子结构最小，故而可以将最小单位的支链分解，导致可以最大限度的利用淀粉，所以在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。故而许多国家都争相开发，但是到现在为止，只有丹麦的NOVO公司具有普鲁兰酶的生产能力。我国只有向其进口，但是其价格昂贵，限制了普鲁兰酶在我国的应用。其实，我国早在七十年代就开发普鲁兰酶的产生菌，但是该菌的酶学性质不适合生产，至今我国在普鲁兰酶的国产化方面还没有报道。 在淀粉的加工行业上，对普鲁兰酶的酶学性质的要求是耐酸耐热，其原因是因为通常使用外加酶化法，由于所用酶类的限制，普鲁兰酶的添加可以在两步反应的任何一步，但必须满足上述的反应的条件。因此所开发的普鲁兰酶的酶学性质必须满足现有的酶法水解制糖的条件，也就是耐酸耐热。 二、普鲁兰酶的研究现状 1.产普鲁兰酶的微生物 普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenfels于1961年通过产气杆菌(Aerobacter aerogenes)发酵获得。他们报道了该酶的良好性能之后，各国的科研人员经过广泛深入的研究，从不同的地区的微生物中获得该酶，掀起了开发普鲁兰酶的高潮。但是迄今为止，尽管发现许多微生物能够产普鲁兰酶，但是由于当今工业生产条件(酸性，温度)，大多数微生物所产的普鲁兰酶并无商业价值。以下便介绍一下普鲁兰酶的生产菌种。 蜡状芽抱杆菌覃状变种(Bacillus cereus ) 由日本的ToshiyukiTakasaki于1975年发现。该菌同时产生两种淀粉酶:β-淀粉酶和普鲁兰酶。最佳作用条件为pH6～，温度50℃，最大转化率(淀粉水解产生麦芽糖)大约为95%.酶学研究中发现，此酶在pH5，温度60℃依然保持大部分活性，该菌的营养细胞呈棒杆状，聚集成长短不等紊乱链状，无运动性，格兰氏阳性，产芽抱时细胞无明显膨胀。该菌最适生长温度30℃～37℃ ,最高生长温度在41℃～45℃，可以利用葡萄糖，甘露糖，麦芽糖，海藻糖，淀粉和糖原。 嗜酸性分解普鲁兰多糖芽抱杆菌() 上世纪八十年代初，丹麦Novo公司获得此菌，此菌所生产的普鲁兰酶耐热 (60℃)，耐酸()。该公司经过投入巨资开发研究，1983年Nov。公司在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名Prornozyme。如今，它是应用最广，产量最大的普鲁兰酶。呈棒状，深层发酵几小时后，可观察到类原生质体的膨胀细胞，较稳定，饱子呈圆柱体或椭圆体。格兰氏反应阳性，37℃生长良好，45℃以上和pI-1高于以上不长，在以普鲁兰糖为碳源的培养基(( ～)上生长良好。 枯草芽饱杆菌(Bacillus subtilis) 1986年，日本的Yushiyuki Takasaki报道了一株能产生耐热耐酸普鲁兰酶的菌种，被命名为Bacillus subtilis TU。此菌种所产生的酶为普鲁兰酶和淀粉酶的混合物，可水解淀粉为麦芽三糖和麦芽搪.水解普鲁兰糖为麦芽三糖，其中普鲁兰酶最佳作用pH为～，但在时亦有约50%的酶活，此普鲁兰酶最佳作用温度60℃。 耐热产硫梭菌(Clostridum Themosulfurogenes) 1987年.德国的等报道了一株能同时产a淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖淀粉酶的菌种:耐热产硫梭菌。该菌种所产普鲁兰酶有较广的温度适应范围(40℃～85℃)，在～有较高的活性，在如此广的范围内都有较强活力无疑将扩大该普鲁兰酶的应用领域. Bacillusnaganoensis,Bacillus deramificans, 上世纪九十年代，Deweer发现了普鲁兰酶产生菌Bacillus naganoensis;Tomimura筛选出Bacillus deramifrcans。这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与Bacillus. Acidopullulyticus的酶学性质相似。这两株菌都是中度嗜酸菌，在以上就不生长，温度超过45℃以上同样也不生长。这两株普鲁兰酶产生菌的发现，进一步拓宽了普鲁兰酶的应用。 产普鲁兰酶的高温菌菌种 自上世纪八十年代以来，人们逐渐意识到在通常的自然条件下，很难筛选得到极端耐热的普鲁兰酶生产菌种，于是各国的科学家便把目光转移到温泉嗜高温细菌的筛选，而且现在已经取得较多的成果。Bacillus如vorcaldarius所产普鲁兰酶的最适温度和pH分别是75～85℃, , Thermotoga maritime的最适温度和pH分别是90℃, , Thermurs caldopHilus的最适温度和pH分别是75℃,, Fenidobacterion pernnavoran最适温度和pH分别是80～85℃, 2.普鲁兰酶的分子结构 至今为止，许多普鲁兰酶的基因己经被克隆，但是还没有见到任何有关普鲁兰酶结构的报道，但是在根据序列相似性对糖普键水解酶的分类，普鲁兰酶属于第13家族，α淀粉酶家族，这个家族中包含了30多种酶，可以分为水解酶，转移酶。异构酶三大类。这些酶能够水解和合成α～,α～,α～,α～,α～,α～糖苷键。其中很多酶的结构已经被报道，它们都采取了(β/α)8的结构，通过生物信息学的研究，这个家族的蛋白都有一个共同的结构，酶的活性中心都是(β/α)8折叠筒的结构，命名为结构域A。第13家族的大多数酶还具有结构域B，它是位于(β/α)8折叠筒中，第三个β片层与第三个α螺旋之间的一段序列，其特点是结构和长度差异较大，推测其功能是与底物的结合有关。在紧接着(β/α)8折叠筒后，还有C结构域，紧接C结构域，部分家族成员还有结构域D。 3.普鲁兰酶的应用 普鲁兰酶，在食品工业中是一种用途广泛的酶制剂和加工助剂。它能专一性分解淀粉中的支链淀粉和糖原分子及其衍生的低聚糖分支中的α～l, 6糖苷键，使分支结构断裂，形成长短不一的直链淀粉。因此，将该酶与 其它 淀粉酶配合使用时，可使淀粉糖化完全。近年来，普鲁兰酶己作为淀粉酶类中的一个新酶种，应用于淀粉为原料的食品等工业部门，在食品工业中有如下几方面的作用: 单独使用普鲁兰酶，使支链淀粉变为直链淀粉 直链淀粉具有凝结成块，易形成结构稳定的凝胶的特性，因此，可作为强韧的食品包装薄膜。这种薄膜对氧和油脂有良好的隔绝性，又因涂布开展性好，故适合于作为食品的保护层。它还适合于淀粉软糖制造，也可用作果酱增稠剂，用于装油脂含量高的食品，以防止油的渗出以及肉食品加工。近年来在食品工业中提倡使用可被生物降解的薄膜，直链淀粉在这些方面具有较大的发展前途。豆类直链淀粉含量较高，因此绿豆淀粉制成的粉丝韧性比其它淀粉好，如果用普鲁兰酶处理谷物淀粉，再制成直链淀粉后，可以制成高质量的粉丝。一般谷物淀粉中，直链淀粉含量仅占20%，支链淀粉含量约为80%。工业上每生产1吨直链淀粉就有4吨副产品的支链淀粉。美国虽然通过遗传育种的方法.得到含直链淀粉60%玉米新品种，但不大适于大量生产。国外已采用普鲁兰酶改变淀粉结构，可使支链淀粉变为直链淀粉。据报道，采用此法收率可达100%.制造直链淀粉的方法为，先采用普鲁兰酶分解经液化的分支部分，使其转变为直链淀粉，并以丁醇或缓慢冷却法沉淀淀粉。再回收含少量水分的晶型沉淀物，最后通过低温喷雾干燥法制成粉状的直链淀粉。 普鲁兰酶与β～淀粉酶配合使用生产麦芽搪 饴糖是我国传统的淀粉糖产品，其中所含部分麦芽糖，广泛用于糖果、糕点等食品工业。目前生产方法是以α～淀粉酶进行液化，再用β～淀粉酶水解支链淀粉，这样只能水解侧链部分。接近交叉地位的α～糖苷键时，水解反应停止。但如果使用普鲁兰酶共同水解，便能使分支断裂，提高淀粉酶水解程度，降低了β极限糊精的含量，大大提高了麦芽糖的产率，有利于生产麦芽搪浆。目前对加普鲁兰酶进行糖化己作了较大规模的试验。 试验条件为。每批投料量约为900公斤碎米，粉浆浓度为15～16Be°数皮用量(对碎米计)，β～淀粉酶活性2,000单位/克以上，;普鲁兰酶活性45,000～55,0 00单位/克，系由产气气杆菌生产，每批用量为1公斤。试验结果表明，加入普鲁兰酶糖化的试验糖与对照糖品相比，还原糖平均增加，麦芽糖含量平均增加了，糊精含量平均减少了高浓度麦芽糖浆较之高浓度葡萄搪浆，具有不易结晶，吸湿性小的特点，所以高浓度麦芽糖浆在食品工业中有着广泛的用途。采用普鲁兰酶与p一淀粉酶配合使用，成本低廉，麦芽糖收率达到70%左右，其至更高。 用于啤酒外加酶法糖化 啤酒生产中麦芽，既是酿造啤酒的主要原料，也为酿造过程提供了丰富的酶源。在啤酒酿造的糖化过程中，麦芽中分解淀粉的主要酶是α～淀粉酶、β～淀粉酶和分解淀粉α～1. 6糖瞥键的R一酶(植物普鲁兰酶或植物茁霉多糖酶)。β～淀粉酶与另两种淀粉酶协同作用，可使淀粉分解成麦芽糖(也包括少量的麦芽三糖和极少量的葡萄糖)和低分子糊精。使麦芽汁有比较理想的糖类组成。在工业生产中为了节约麦芽用量，采用所谓外加酶法糖化，即在减少麦芽用量的前提下，增加淀粉质辅助原料的比率，并加入适当种类的酶制剂进行搪化。要使大麦及其它辅助原料糖化完全，需要外加a一淀粉酶和分解α～糖苷键的普鲁兰酶制剂等。单独使用a一淀粉酶时产生麦芽糖和麦芽三搪是很不完全的。假如分解淀粉α～糖苷键的酶活性不足，淀粉分解就不完全，其结果是可发酵性糖含量低，制成的啤酒发酵度达不到要求。若采用能分解α～和α～糖苷键的糖化型淀粉酶，则其反应产物为葡萄糖，容易使酒味淡薄。采用普鲁兰酶与α～淀粉酶协同，效果良好，其分解产物主要是麦芽糖和少量的麦芽多糖。采用外加酶法糖化时，加入酶制剂的用量为:淀粉酶6～7单位/克大麦及大米:蛋白酶，60-80单位/克，并配合以菠萝蛋白酶10ppm，普鲁兰酶50单位/克大麦。以上三种酶制剂均添加于糖化或酒化开始。 总之，普鲁兰酶无论作为酶制剂和食品工业的加工助剂均有广阔的发展前途。 研究目的和意义： 酶制剂工业是上世纪七十年代就己经形成的一个重要的产业，目前世界酶制剂总产值达100亿美元，我国的产值约为100亿人民币，并且随着其应用领域的不断扩大以及新酶种的开发，这一市场正在迅猛发展。但是全球酶制剂产业几乎被几家外国公司所垄断，其中丹麦的NOVO公司几乎占全球总销售额的一半。本研究对普鲁兰酶的开发，对酶制剂产业的发展有重要的意义。 其次我国自从七十年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但是所开发得到的普鲁兰酶，既不耐热也不耐酸，这就使其在工业化应用中受到了局限。为了改变我国对进口产品的依赖，填补我国这一领域的空白，寻找一条国产化的道路，本研究的目的是利用自然微生物资源，普鲁兰酶，提高我国淀粉原料的利用率，从而提高整个淀粉加工行业的生产率，这对我国淀粉加工产业的意义是不言而喻的。 研究内容(内容、结构框架以及重点、难点)： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集; (2)菌种初筛; (3)菌种复筛; (4)菌种保藏方法; (5)酶活力测定方法的建立。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响; (2)初始PH对发酵产酶的影响; (3)接种量对发酵产酶的影响; (4)发酵温度对产酶的影响; (5)金属离子对产酶的影响。 重点或关键技术： (1)纯菌株的分离; (2)菌株的鉴定方法的选择。 研究方法、手段： 一.普鲁兰酶产生菌的筛选 (1)样品的采集：选择适合产生的地点(面粉厂.菜地.果园等)采集土样 (2)菌种初筛：在采集的土样用无菌水稀释后，在含有淀粉类的培养基中做平板涂步， 37℃培养48h后，用碘液进行显色反应，将有淀粉酶产生的菌落接于斜面中保存。 (3)菌种复筛：将前期分离的能产生淀粉酶的菌株涂步于普鲁兰糖平板上，37℃培养48h后用95%乙醇进行透明圈实验。有透明圈产生说明菌株产生普鲁兰酶，将产生透明圈的菌落挑于斜面培养基培养。 (4)菌种保藏方法： 采用4℃低温保藏。 (5)酶活力测定方法的建立：采用发酵培养液经过离心后利用DNS显色法 520nm测定吸光值，测定标准葡萄糖标准曲线，利用标准曲线计算普鲁兰酶酶活大小。 二.产普鲁兰酶菌株的产酶条件的研究 (1)碳源，氮源对发酵产酶的影响：采用不同碳源，氮源培养基培养一段时间，测定酶活力。(其他条件相同：接种量，装瓶量，初始PH值，转速，培养时间。) (2)初始PH对发酵产酶的影响：采用相同发酵培养基，在不同初始PH下接种等量种子液。在相同条件下培养，测定发酵液的酶活。(其他条件相同：接种量，装瓶量，转速，最佳培养温度，最佳培养时间。) (3)接种量对发酵产酶的影响：在发酵培养基中分别接入2%，4%，6%，8%， 10%，14%，18%的种子培养液于最佳碳源，氮源，最佳初始PH的培养基中，在相同条件下培养，分别检测酶活。(采用以上确定的最佳碳源，氮源，最佳初始PH。) (4)发酵温度对产酶的影响：采用相同培养基，在不同温度下(25℃，30℃，35℃，40℃，45℃)培养一定时间，测定酶活力。 (5)金属离子对产酶的影响：在基础培养基中加入少量不同金属离子，发酵后测酶活。(金属离子有： 锰离子，钙离子，锌离子，镁离子，铁离子，铜离子。) 研究进度 ：完成项目总体进度30%，样品土样的采集及前期的准备工作,菌株的初筛，包括(样品土样原液的涂步培养及摇床培养，产支链淀粉酶菌株的挑选及斜面培养)。 ：完成项目总体进度50%,菌株的复筛，包括(产普鲁兰酶菌株的筛选及斜面培养),葡萄糖标准曲线的测定,酶活测定方法的建立,并以酶活大小对菌株进行再次筛选。 ：完成项目总体进度80%,产酶条件的研究。包括：碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。并通过各中单因素试验确定发酵培养基的最佳碳源，氮源，初始PH值，接种量，发酵温度，金属离子。 2009、4—2009、5 ：完成项目总体进度100%,课题总结，撰写论文。 文献综述(包括：国内外研究理论、研究方法、进展情况、存在问题、参考依据等) 自从1961年Bender H.等人在研究一株产气气杆菌Aerobacter aerogenes(典型菌为肺炎克雷伯氏杆菌)时首次发现普鲁兰酶后，国际上对产生这种酶的微生物进行了广泛研究，发现许多微生物可以产生此酶，并筛选出一些适用于工业化生产的优良菌株。随着该酶的应用发展，对耐热性普鲁兰酶的研究也逐渐增多，已成功克隆并表达了该酶的基因。国内1976年开始对一株产气气杆菌(Aerobacteraerogenes 10016)的普鲁兰酶进行研究，对该菌株的产酶条件、酶的分离提取及酶学性质作了报道，并研究了该酶的食品级提取技术。此外，陈朝银、刘涛等人从云南温泉水样中筛选到一株产普鲁兰酶高温栖热菌菌株，通过诱导等实验将该酶的酶活从提高到170u/mL，酶产量提高了近2500倍左右，酶的最适作用温度及pH分别是75℃和，具有一定的耐热和耐酸特性。 陈金全等从温泉水样中筛选到一株产耐热耐酸普鲁兰酶的野生菌株，并根据形态、生理生化特征、细胞化学组分分析及16SrDNA序列比对、基因组DNA的G+C摩尔百分含量、同源性比对等实验，鉴定其为脂环酸芽抱杆菌属(Alicyclobacillus)的一个新种，所产酶最适作用温度为60℃，最适pH值，具有较好的耐热耐酸特性。杨云娟等利用毕赤酵母成功构建了普鲁兰酶表达量较高的基因工程菌，摇瓶发酵酶活可达，最佳发酵条件下产量可达 .酶的最适作用温度为600C，最适pH值，具有较好的耐热耐酸性。目前我国仍没有具备独立生产普鲁兰酶能力的厂商，要实现低成本、国产化的生产，还有很长的路要走。 技术应用于耐热脱支酶的研究，使耐热异淀粉酶的研究有了很大发展。Coleman等人将嗜热厌氧菌T. brockii普鲁兰酶基因克隆到中得到的克隆子分泌的普鲁兰酶数量高于出发菌株，Okada等人将Bacillus Steanther, onhiu:中编码热稳定异淀粉酶的基因克隆到:中，得到的转化菌株其异淀粉酶能在60 ℃稳定15分钟。Burchadf将。ostridium thermosulf urogenes DSM38%的嗜热异淀粉酶基因克隆并在中表达，所得酶的最适pH和最适温度与出发菌相同，而且在高温下仍能保持活性.Antranikiam等人将Pyrococcus舟riousous的异淀粉酶基因克隆到中并分离得到了酶蛋白。尽管如此，目前尚未有已将转基因的耐热性异淀粉酶工程菌应用到工业生产中的报道。众所周知，利用物理和化学诱变剂单独或复合处理微生物细胞是选育高产变种菌株行之有效的经典方法，它在为培育多种抗生素、氨基酸、核苷酸激酶(尤其是蛋白酶和淀粉酶)的高产变种菌株方面曾经起过极为重要的作用，至今仍然是方便易行和行之有效的方法之一。 主要参考文献： [1][美]惠斯特勒等编王雏文等译.淀粉的化学与工艺学[M].北京：中国食品出版社，1988 [2]张树政.酶制剂工业[M]. 北京: 科学出版社，1998 [3]邬显章.酶的工业生产技术[M]. 吉林: 吉林科学技术出版社，1988 [4]Taniguchi H, Sakano Y, Ohnishi M, Okada G(1985) Pullulanase[J].TanpakushitsuKakusan Koso. 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生物学发展百年史: 生物学是一门研究活的有机物质的科学，地球上总共有超过一千万个以上的物种，从必须要在显微镜底下才能观察的细菌到徜徉在大海里的蓝鲸和森林里面的老神木，都是生物学家关心的范围。有一些不同的特质，是生命型式与非生命最基本的差异，例如生命个体可以繁殖、生长、新陈代谢并且对外在的环境做出反应。生物学包含的范畴相当的广泛，型态学、微生物学、生态学、遗传学、分子生物学、免疫学、植物学、动物学、细胞生物学、环境化学等都为其所涵盖。 而近几年来生物科技成为热门话题，举凡「基因工程」、「DNA复制」、「基因疗法」等这些科学领域中人所熟悉的语汇，突然间成为普罗大众注目的焦点；原本镇日埋首於研究室中做实验的研究工作者们，在人们心中的印象也由「整天做那些玩意儿，到底是有什麼用啊？」转变为「搞生物科技的科学家耶，好厉害喔，一定很赚吧？」面对这样子的转变——没没无闻到掀起风潮——对加快研究脚步固然有所帮助；然而对想一窥究竟、没受过相关专业训练的社会大众来说，科学术语背后所代表的意义毕竟太过艰涩难以理解，但吸收资讯、增进学识之路不应该这样就被阻断，因此，进入生物科技的殿堂窥探其奥妙最好的入门方式便是由浅显易懂的生物学发展史著手。 西元1954~1974年可说是生物学发展百年史中最具承先启后代表性的时代，此时生物学家已逐渐由探讨「会是怎样」转变为「为什麼会这样」，故从观察现象慢慢进入了基因表现的领域。而华生和克力克发现了DNA双股螺旋结构无疑地是划时代的重大成就，此一发现加快了相关的研究脚步。 1954年，美裔俄国物理学家George Gamow提出遗传物质的讯息以三个碱基为一个单位依照顺序排列在DNA分子上；此一论点在1961年被英国分子生物学家Frnacis Crick和北非化学家Sydney Brenner证实：每三个在DNA上的盐基序列就指向一个截然不同的氨基酸。而美国遗传学家Joshua Lederberg和Norton Zinder在1955年的发现——性状引入作用(Transduction) ：病毒可以将部分的遗传物质传递给细菌——在往后的基因研究工作上成为一个非常重要的工具。 1956年，美裔罗马尼亚生物学家Geroge Palade发现核糖体并且包含著RNA；於此同时，美裔西班牙分子生物学家Servero Ochoa更进一步找到合成RNA所需要的一种多核苷酸-磷酸酶(Polynucleotide phosphorylase)——之后这个酵素被广泛用来合成RNA。美国生化学家Arthur Kornberg则是利用放射线标定核苷酸并且在大肠杆菌上发现了一个合成DNA的酵素：DNA聚合酶——此酵素在往后几年被他利用於试管中合成DNA。 在遗传讯息的复制、表现方面，美国生物学家Maklon Hoagland与Paul Zamecnik於1956年发现tRNA可以携带氨基酸并且结合到mRNA上正确的位置；法国生物化学家Francois Jacob和Jacques Monod则在1961年确定mRNA的功能是将遗传密码自核内的DNA传递到核糖体，并参与蛋白质生成的过程。1967年研究又有两个新发现：美国科学家Charles Caskey和同事证实在不同的生物个体中，同一段mRNA制造相同氨基酸序列；美国生化学家Marshall Nirenberg则是证实哺乳类、两栖类以及细菌都使用相同的遗传密码。 到了1968年，美国遗传学家Mark Ptashne和Walter Gilbert成功分离出第一个具有抑制功能的DNA，代表著人类对DNA的概念由「表现基因的功能」演变成「具有调控的机制」；美国遗传学家Jonathan Beckwith和同事们更进一步於1969年在哈佛大学的医学院实验室中第一次分离出了单一的基因。 1970年可说是基因研究发展相当灿烂的一年，美裔印度生化学家Har Gobind Khorana成功组合了一段人工合成的酵母菌基因，这个结果宣示了人工合成基因的可行性。美国生化学家Howard Termin和David Baltimore发现一些RNA病毒能利用反转录酶将它们的遗传物质(RNA)反转录为DNA，这样一段经过反转录后的DNA经由病毒蛋白质的作用可以镶嵌在宿主的DNA上。美国遗传学家Hamilton Smith则是发现第二型的限制酶——这种酵素可以切断DNA双股螺旋於特定的辨识切点上——此一发现使得基因重组不再是空想，成为可能。 到了1972年，美国微生物学家Daniel Nathans使用限制酶(切DNA双股螺旋分子的酵素)去标定一种会造成猴子癌症之病毒(Monkey Simple virus)的DNA——这是第一次使用这一类酵素来对一段已知的DNA进行标定的工作，此时已逐渐为往后的基因定序工作铺路。美国生物化学家Stanley Cohen和Herbert Boyer更进一步於1973年时，将来自某一物种的DNA被限制酶酵素切成几个片段，并且放入其他物种的DNA内发展出重组DNA的技术，此为基因工程技术的起始点。 除了基因相关研究蓬勃发展之外，同一时代其他领域的知识亦日新月异。在疾病防治方面，1954年二月美国的生物学家沙克医生(Jone E. Salk)发展出沙克小儿麻痹疫苗，接种在宾州匹兹堡的小孩子上帮助他们抵抗小儿麻痹的侵袭——这是人类第一个有计画、大规模的疫苗注射试验。1955年四月，接种结果证明沙克疫苗的确能有效帮助遍布四十四州的孩童抵抗小儿麻痹。因此在1956年七月，沙克医生参与美国医学年会时与另外一位外科医生Leonard 便乐观地预期小儿麻痹将在未来三年内从人类社会中消失。 1965年美国病毒学家Daniel Gajdusek和Clarence Gibbs成功地将库鲁症及人类库甲氏症(狂牛病)传染给灵长类，证明不同物种之间可以相互传染疾病。同年美国生物化学家Robert Woodward合成抗生素「头孢酶素C」以解决日益严重的细菌感染问题。1972年瑞士研究人员. Borel发现了cyclosporin-A药物对於免疫反应具有抑制的效果；同年美裔维吉尼亚免疫学家Baruj Benacerraf和Hugh ONeill McDevitt确认免疫反应是受到基因层面的调控的。 在医疗健康方面，1954年美国乌斯特基金会的科学家Gergory G. Pincus, Hudson Hoagland以及Min-Cheh Chang发展出荷尔蒙避孕方法。1957年七月，美国外科医师Leroy E. Burney发现了吸烟与导致肺癌之间的关系；同年，乌斯特基金会科学家Gregory Pincus以及波士顿的妇产科医生对波多黎各展开了药物控制的家庭计画。Cleveland General医院则於1964年成功地藉由神经外科手术自恒河猴身体取出活的脑部组织。 1969年二月十五日，英国生理学家Robert Edward在剑桥大学的生理实验室完成第一个体外受精的人类卵细胞，这个成果开启了人工生殖弥补自然生殖缺憾的新页，点燃不孕症夫妇养育下一代的希望曙光。同年九月十五日，加州的史丹佛医学中心进行全球首例的心脏与肺脏移植手术，将人类的活体移植发展更向前推进一步。1971年一月六日，加州大学医学中心的Choh Hao Li团队成功合成出人类的成长荷尔蒙：somatotrophin。同年加拿大的外科手术医生Frank H. Gunston发展出替换膝关节的方法；英国生理学家. Bassett、. Pawluk和. Becker证实使用电流刺激可以加快骨折康复的速度；美裔波兰细胞学家Andrew Schally分离出对人类排卵来说非常重要的促滤泡成熟激素。 1971年外科医师发展出突破性的诊断技术——内视镜，这个发明使得医生可以藉著插入导管在没有进行手术的情况下直接看到人体的器官的状况，令医疗诊断技术更上一层楼。同年，抗癌药「紫杉醇」(Taxol)由太平洋紫杉木的树皮被分离出来，无疑地成为众多身受癌症之苦的病患最大的福音。而根据英国皇家外科医学院的研究结果显示，因吸烟导致死亡的人数相当於十九世纪时死於伤寒及霍乱的人数。英国工程师Godfrey Hounsfield於1972年对人体成功的进行了第一次「电脑断层扫描」，再度为疾病诊疗技术写下新页。1973年人类成功孕育出第一只来自冷冻胚胎的小牛；同年美国3M公司制造出第一只耳蜗型的助听器。1974年六月，美国外科医生Jay Heimlich发明了“哈姆利克急救法”。 至於生命组成物质的部分，1955年英国生物化学家Dorthy Hodgkin确定了维他命B12的结构——一种肝脏的萃取物，被认为可以医治恶性贫血。1959年英裔澳洲生化学家Max Perutz发现血红素的结构。1960年英国生化学家John Kendrew使用X光绕射的技术，阐述肌肉蛋白中肌球素Myoglobin的立体结构；同年美国生化学家Robert Woodward和德国生化学家Martin Strell合作合成叶绿素。1963年美国生化学家Robert Woodward合成秋水仙素，这种植物性的化学药物可以改变染色体套数使得生物体异常硕大，被广泛运用於作物改良上。 其他方面，1957年美裔俄国工程学家Vladimir Zworykin获得了藉由电子萤幕显现显微镜视野的专利——这个发明增进观察微生物、细胞等物质的便利性。1960年英国珍古德博士发现黑猩猩也会像人类一样制造并使用工具，例如把草编织成类似针刺的形状，插入白蚁巢穴中，驱逐白蚁。1962年福特基金会在菲律宾创立稻米研究机构，并且开始繁育出超过一万种的稻米品种。。1963年澳洲动物学家Konrad Lorenz认为只有人类这个物种会倾向於杀掉自己的族群及具有侵略性的行为，而这些行为都是天生的并且可以被后天环境所改造。1964美国动物学家William Hamilton发现利他行为在动物社群中的重要性，开启了社会生物学的发展。1968年美国科学家Elso Sterrenberg Barghornc和他的同事报导了在岩石上残存了三十亿年的氨基酸，证明三十亿年前地球就存在著氨基酸一直到现在)。 而科学发展急速推进的结果，造成环境某些问题逐渐浮现，因此Rachel Carson於1962年在「寂静的春天」一书当中呼吁全人类注意化学药品对环境的杀伤力。1972年因为DDT已经被证实会影响鸟类的生育能力，故美国政府开始限制DDT的使用。来自七个国家的的代表在1973年签署国际贸易协定，明文禁止运送以及贩售包含象牙等375个濒临绝种的动物及植物。1974年7月，由於害怕制造出威胁生态及人类的新物种，美国科学协会建议停止重组DNA的试验。 简短叙述了1953年到1974年的生物学发展，然而，无论到目前为止累积了多少的生物学知识，已知的与未知的一比总是有如九牛一毛，不过是沧海中的一粟；时代在演变，科学研究亦不断前进、前进、再前进，从前人的结果学习先贤的思维模式、实验态度，不但作为借镜，也能引以为明灯

具体有以下几种类型：M——专著C——论文集N——报纸文章J——期刊文章D——学位论文R——报告，采用字母“Z”标识。对于英文参考文献，还应注意以下两点：1、作者姓名采用“姓在前名在后”原则，具体格式是：姓，名字的首字母。2、书名、报刊名使用斜体字。