基因编辑细胞病论文

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（）被认为是巨噬细胞的最佳模型之一，因为该细胞能够进行胞饮和吞噬作用，在炎症、免疫、凋亡、肿瘤研究应用广泛。细胞在体外可以对刺激产生反应，并随后产生具有破骨细胞完全分化的特征的多核细胞，被广泛用于研究骨骼疾病如风湿性关节炎、骨质疏松症、骨质溶解、牙周炎等。是单核细胞/巨噬细胞样细胞系，源自BALB/c 微小核糖核酸的Abelson白血病病毒转化细胞系。RAW 是破骨细胞、炎症研究最常用的体外模型之一。 1. 破骨细胞生成研究： RAW 已被证明在RANKL诱导下容易分化为破骨细胞。与原发性破骨细胞前体不同，RAW 的分化无需添加巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。 2. 炎症研究： 是筛选抗炎活性物和研究炎症最常用的体外研究模型。在诱导剂（如脂多糖LPS）的作用下，细胞会模拟炎症反应，释放或上调多种炎症介质如一氧化氮（NO）、环氧合酶-2（COX-2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）等。 据报道，类风湿关节炎(RA)影响着全世界2100多万人。RA是一种影响关节的自身免疫性炎症疾病。它的特征是巨噬细胞和淋巴细胞浸润，滑膜成纤维细胞增殖，最终的关节破坏。巨噬细胞在RA发病机制中发挥重要作用。RA炎性滑膜中巨噬细胞数量高于正常关节，与关节疼痛和炎症的严重程度呈正相关。许多药物已经被批准用于治疗风湿性关节炎，基因或细胞疗法。 MicroRNA 155 (miR-155)在小鼠16号染色体和人类21号染色体的BIC基因中被发现。在临床和实验模型中，miR-155与RA的发病机制有关，因为它在RA患者的滑膜和滑膜液巨噬细胞中上调。siRNA干扰miR-155 (KD)可以抑制促炎细胞因子的产生。miR-155参与RA形成的机制可能是多方面的，其中之一是miR-155靶向Src同源性-2的3个未翻译区域，其中包含肌醇磷脂酶1 (SHIP1)，炎症的负调节因子。因此，RA中升高的miR-155导致SHIP1水平降低，导致促炎细胞因子的产生升高。 研究者利用CRISPR/CAS9技术成功突变小鼠巨噬细胞内源性miR-155基因，获得miR-155基因组敲除(GKO)克隆 。进一步分析表明，在LPS刺激下，miR-155 GKO克隆表达更高水平的SHIP1，但产生较少的促炎细胞因子。 通过使用miR-155 GKO克隆，去除miR-155会导致巨噬细胞产生促炎细胞因子的减少，从而证实了之前的观察，即升高的miR-155有助于RA患者细胞因子产生的持续水平。通过将miR-155模拟物转染回GKO克隆，研究者能够重新引入miR-155效应。总之，这些结果表明，内源性miR-155基因的突变可能导致pre-miR-155产物被截断，无法成熟为更短但稳定的miR-155。 NLR家族蛋白NLRP3是外源性病原体和内源性损伤相关分子模式(DAMPs)的胞质传感器。NLRP3激活后，与适配器蛋白ASC和半胱氨酸蛋白酶caspase-1组装，形成NLRP3炎性小体，导致caspase-1的裂解和激活。活化的capase-1裂解IL-1的细胞因子和IL-18的前体，使其成熟，并导致几种促炎细胞因子的释放，包括IL-1的细胞因子和IL-183。据报道，NLRP3炎症小体在多种炎症疾病的发生和发展中起重要作用。抑制NLRP3炎症小体信号已被证明在减轻败血性休克、腹膜、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、T2D、多发性硬化、和痛风等疾病中有效。因此 NLRP3炎性小体是治疗多种炎性疾病的一个极好的靶点 。 利用CRISPR/Cas9在基因组水平上直接破坏关键分子-NLRP3，不仅可以完全抑制NLRP3炎症小体的激活，还可以避免抑制抗炎生物制剂和抑制剂的脱靶途径的潜在风险。 研究CRISPR/Cas9敲除NLRP3的策略有望成为治疗多种炎症性疾病更有效的方法 。 在这项研究中，研究者报道了一个系统的传递系统CRISPR/cas9 将mCas9和gNLRP3封装进CLAN中。CLAN是一种以PEG -b- PLGA为基础的纳米颗粒，辅以阳离子脂质BHEM - Chol，用于核酸治疗的递送。在之前的工作中，研究者们已经将小干扰RNA、RNA适配体和乙肝病毒CpG导入肿瘤细胞、心肌细胞、巨噬细胞或浆细胞样树突状细胞CLAN。 然而，mCas9/gNLRP3不同于其他核酸疗法，纳米颗粒的性质影响给药效率。为检测CLAN42是否能有效递送mCas9/ gRNA，研究者将Cas9和增强绿色荧光蛋白(EGFP)共表达mRNA (Cas9-EGFP mRNA，或mCas9-EGFP)及阴性对照gRNA (gNC)封装到选择的CLANs(CLANmCas9-EGFP/gNC)中。用不同的CLANmCas9- EGFP/gNC转染骨髓源巨噬细胞(BMDMs)。转染组EGFP阳性的BMDMs百分比最高。接下来，研究者通过转染稳定表达GFP ()的细胞(巨噬细胞系)和包裹mCas9和gRNA靶向GFP (gGFP)的CLAN(CLANmCas9/gGFP)检测基因敲除效率。转染组中gfp敲除(KO) 细胞比例最高，达。研究者通过向小鼠注射不同的CLANmCas9- EGFP /gNC进一步证实了CLAN42的体内mCas9/gRNA传递效率。注射组EGFPpositive腹膜巨噬细胞的百分比最高()。综上所述， 由于其巨噬细胞摄取能力最强，所以在mCas9/gRNA传递中，CLAN42是最有效的，并且CLAN42更适合包封mCas9/gNLRP3(记为CLAN mCas9/gNLRP3 )用于多种炎症性疾病的治疗 。 因此，研究者通过调整聚合物中阳离子脂质BHEM-Chol的重量和PEG5K-b-PLGA11K的质量分数，建立了不同表面电荷和PEG密度的基团库。研究者在体外和体内都筛选了家族，并选择了一个更好的家族来将mCas9/gNLRP3导入巨噬细胞中，通过破坏巨噬细胞中的NLRP3来改善脓毒症休克，mCas9/gNLRP3诱导的腹膜炎和HFDinduced T2D。研究为CRISPR/Cas9进入巨噬细胞和治疗多种炎症性疾病提供了一个有前景的策略。 研究结果证明了CLANmCas9/ gNLRP3是一种很有前途的治疗NLRP3依赖性炎症性疾病的方法。研究也为通过纳米颗粒介导的免疫细胞基因编辑治疗免疫相关疾病提供了一个范例。

细胞工程论文

细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。下面是我为大家整理的细胞工程论文，欢迎阅读。

【摘要】 目的制作去细胞肌肉组织工程支架，并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法 采用TNT和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架，冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7 d后，用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT3及BDNF的表达,扫描电子显微镜观察其超微结构。结果 支架中细胞去除完全，其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性，并呈现NT3、BDNF免疫反应阳性。扫描电镜显示，羊膜上皮细胞在支架中分布均匀，生长良好。结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架，其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。

【关键词】 去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性

近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche等〔1〕把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处,4 w后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限，去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子〔4，5〕，促进神经元轴突的生长，是一种良好的治疗神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方法制成去细胞肌肉支架，并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内，探究两者的相容性，为开展组织工程治疗神经系统方面的疾病提供新的途径。

1 材料与方法

材料

实验动物 Wistar 大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。

试剂 IMDM培养基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 单克隆抗体购自Neomarker公司;神经营养素(NT)3,脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司，SABC免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。

方法

去细胞肌肉支架的制备 参考 Brown等〔6〕去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架，简述如下：取Wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50 r/min摇48 h后,转入3%的TritonX100溶液,摇床中37℃、50 r/min摇48 h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃、50 r/min摇48 h。换成1% SDS溶液，摇床37℃，50 r/min摇48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存备用。

支架形态结构的观察及成分鉴定 肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖过夜以梯度脱水，OCT包埋，冷丙酮速冻，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机切片，HE 染色，观察其内部结构。此外对切片进行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)检测支架的细胞外基质成分。

人羊膜上皮细胞的培养 人羊膜上皮细胞在DMEM培养液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，200 μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后，传代培养。

人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定

取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合，弃去培养液，胰蛋白酶消化，当胞体回缩，细胞间隙变宽时，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液于离心管中，1 000 r/min，离心3 min。用DMEM重悬细胞。用1 ml注射器吸入细胞悬液，以2×106/ml 密度注入去细胞肌肉支架中分装至24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，培养1 w。掺入Brdu(终浓度为10 mg/L)，继续培养1 d后，恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经PBS 洗后，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，血清封闭20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀释)单克隆抗体，BDNF和NT3多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜，PBS 洗后，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗后，SABC37℃孵育30 min，DAB显色。光镜下观察。

扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合时，用上述方法消化下来后，把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养7 d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥，镀膜，采用扫描电子显微镜观察并拍照。

2 结 果

支架的组织结构与成分 去细胞肌肉外观呈乳白色,半透明,质地柔软。从大体上看，肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的HE染色观察可见骨骼肌细胞成分消失,而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道。VG+ET染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分，胶原纤维为红色波浪状结构，弹性纤维为蓝色丝状结构，见图1。

羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性 见图2，HE染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好，分布均匀(图

图1 去细胞肌肉支架大体与组织切片染色

图2 去细胞肌肉支架的病理图片2A)。免疫组化染色显示，BrdU阳性细胞数目多，提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(图2B)。抗NT3和BDNF染色显示，支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3、BDNF阳性颗粒，呈棕褐色分布在细胞质中(图2C，2D)。JSM5600LV扫描电子显微镜显示，在支架内部分布有大量细胞，细胞在支架中分布比较均匀，生长状态良好(图2E)。

3 讨 论

理想的支架材料应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去细胞肌肉作为治疗神经损伤的生物工程支架材料有如下优势：(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的'迁移、黏附、生长代谢都有重要作用，研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细胞肌肉支架上〔9〕。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似,仅在直径上略大于神经膜管〔10〕，它们提供了轴突可生长穿过的足够空间〔9〕，该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。 Fansa等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉，静脉，神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果，发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的，而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的〔11〕。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免疫排斥反应较小〔9，12〕。这些优势都说明去细胞肌肉可作为治疗神经损伤的理想的材料。本研究采用的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布，其细胞外基质成分也是平行分布的，从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的，VG+ET染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。

由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限〔13〕，去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明，羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子，包括黏蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质,IL1，IL8 等因子，另外，还可分泌BDNF和NT3等重要的神经营养因子〔4〕。其中层黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子对神经损伤的治疗具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞，与去细胞肌肉支架结合可能成为治疗神经系统疾病的一个理想的组织工程材料。本实验观察到人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中分布均匀，抗BrdU、BDNF及NT3免疫组化显示去细胞肌肉支架中羊膜上皮细胞有良好的增殖能力，并能表达BDNF和NT3，说明羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中保持了良好的生物学活性。以上结果一方面证明了本研究制作的去细胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面为应用羊膜上皮细胞和去细胞肌肉支架结合治疗神经系统疾病提供了理论和实验基础。

总之 ，本研究成功制备了去细胞肌肉支架，并证实人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中能分泌重要的神经营养因子，人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等种种有利因素，构成了良好的神经再生微环境，有利于使神经缺损得到较好地修复，为进一步研究羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体治疗神经损伤奠定了一定的实验基础。

【参考文献】

1 Mligiliche N，Kitada M，Ide of detergentdenatured skeletal muscles provides effective conduits for extension of regenerating axons in the rat sciatic nerve〔J〕.Arch Histol Cytol，2001;64 (1):2936.

2 Fansa H，Keilhoff G，Forster G,et muscle with Schwanncell implantation：an alternative biologic nerve conduit〔J〕.J Reconstr Microsurg,1999;15(7):5317.

3 Gulati AK，Rai DR，Ali influence of cultured Schwann cells on regeneration through acellular basal lamina grafts〔J〕.Brain Res，1995;705(12):11824.

4 朱 梅，陈 东，盂晓婷，等.羊膜上皮细胞移植治疗帕金森病大鼠的实验研究〔J〕.中国老年学杂志,2006;26(2)：2279.

5 Meng XT，Chen D，Dong ZY,et neural differentiation of neural stem cells and neurite growth by amniotic epithelial cells coculture〔J〕.Cell Biol Intern，2007;31：6918.

6 Brown AL，BrookAllred TT，Waddell JE,et acellular matrix as a substrate for studying in vitro bladder smooth muscleurothelial cell interactions〔J〕.Biomaterials，2005;26：52943.

7 Suh JK，Matthew of chitosanbased polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering：A review〔J〕.Biomaterials，2000;21(24)：258998.

8 Grande DA，Halberstadt C，Naughton G,et of matrix scaffolds for tissue engineering of articular cartilage grafts〔J〕.J Biomed Mater Res，1997;34(2):21120.

9 Fansa H，Schneider W，Wolf G,et responses after acellular muscle basal lamina allografting used as a matrix for tissue engineered nerve grafts〔J〕.Transplantation,2002;74(3):3817.

10 李培建,胥少汀.去细胞肌肉支架移植及神经生长因子对脊髓横断性损伤的修复作用〔J〕.中国脊柱脊髓杂志，2000;10(4)：2203.

11 Fansa H，Keilhoff of different biogenic matrices seeded with cultured Schwann cells for bridging peripheral nerve defects〔J〕. Neurol Res,2004;26(2):16773.

12 Brown AL，Farhat W，Merguerian PA,et week assessment of bladder acellular matrix as a bladder augmentation material in a porcine model〔J〕.Biomaterials,2002;23：217990.

13 李培建，李兵仓，胥少汀.肌基膜管移植修复脊髓缺损的实验研究〔J〕.中华创伤杂志,2001;17(9)：5258.